T_SHRH 027-2019 体外测试 B16细胞黑素合成抑制实验.docxVIP

ICS?71.100.70

C2682

Y42

T/SHRH

团 体 标 准

T/SHRH?027-2019

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体外测试?B16?细胞黑素合成抑制实验

In?Vitro?Test?-Inhibition?of?Melanin?Synthesis?in?B16?Cells?Test

2019-12-30?发布 2020-01-30?实施

上海日用化学品行业协会?发布

T/SHRH?027-2019

目 次

前言…………… 2

1．范围…………………………??3

2.?原理……………………… 3

3.?测试仪器………………… 3

4.?试剂……………………… 3

5.?试验方法………………… 3

6.?结果计算………………… 4

7.?试验有效性认证………… 4

8.?结果报告………………… 4

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T/SHRH?027-2019

前 言

本标准按照?GB/T1.1-2009?给出规则起草。

本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。

本标准起草单位：上海家化联合股份有限公司、东阿阿胶股份有限公司、上海上美化妆品有限公司、

上海创元化妆品有限公司、广东博溪生物科技有限公司、福建片仔癀化妆品有限公司、上海绿瑞生物

科技有限公司、云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司、上海清轩生物科技有限公司、上海天祥质量

技术服务有限公司、上海日用化学品行业协会。

本标准主要起草人：陈媛祺、曹平、陈田、廖峰、?陈静、廖筝筝、曾四立、吴梅芳、卢永波、陈

贞明、谢阿贵、姜春鹏、赵奕竹、马骁、王飞飞、高宏旗、朱翠翠、?李琼、金坚、陈亦华。

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T/SHRH?027-2019

体外测试 B16?细胞黑素合成抑制试验

1 范围

本标准规定了B16细胞黑素合成抑制试验的基本技术要求，提供一种美白原料的细胞评估方法，适

用于宣称通过抑制黑素生成而达到美白效果的原料的功效评价。

2 原理

B16小鼠黑素瘤细胞是常用的研究黑素生成的细胞模型，通过测定美白原料作用于黑素细胞后黑素

合成量的变化，评价原料的美白活性。

3 测试仪器

3.1?分析天平：精度?0.1?mg；

3.2?CO2?培养箱；

3.3?倒置显微镜；

3.4?离心机；

3.5?可调节移液枪：1000?μL、200?μL、50?μL、10?μL；

3.6?细胞计数器；

3.7?恒温水浴锅；

3.8?生物安全柜；

3.9?酶标仪。

4 试剂

除有另外说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T?6682规定的一级水，与细胞培养相关试剂、

耗材均需经过无菌处理。

4.1 B16?细胞；

4.2 细胞培养涉及试剂及耗材：1╳?PBS、细胞培养液（DMEM（1╳?，含?4.5g/L?D-Glucose）?+10?%

胎牛血清?+?1?%?混合抗生素（100╳））、0.25%?Trypsin?（1╳）、6?孔细胞培养板、96?孔细胞培养板、

细胞培养瓶；

4.3 黑素提取液：配制含有?10?%?DMSO?的?1?mol/L?NaOH。

5 试验方法

5.1 细胞收集：吸掉培养瓶中的培养液，用?1╳?PBS?洗两遍，然后加入?0.25%?Trypsin（1╳）（T

25?培养瓶中加入?500?μL，T?75?培养瓶中加入?1mL），放入?CO2?培养箱中消化?3-5?分钟，显微镜

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下观察细胞脱离培养瓶后，即可加入?5?mL?细胞培养液终止消化，并收集培养瓶中的细胞于离心

管中，1000?rpm?离心?3?分钟。

5.2 细胞计数：弃去上清，细胞重新悬浮于离心管中，计数细胞浓度。

5.3 细胞铺板：用细胞培养液调整细胞密度至?2.5×103?个/?mL，然后将细胞悬液铺于?6?孔板中，

每孔?2?mL。注：每次测试需设定阴性对照组、受试样品组和阳性对照组，每组均设立三个复孔。

5.4 样品配制：待测样品的浓度应选择不影响细胞生长的浓度，即为细胞的无毒浓度。液体样

品需过滤除菌，再用细胞培养液稀释至相应的浓度；水溶性固体样品先用?1╳?PBS?溶解至高浓度，

后过滤除菌，再用细胞