SN 1559.1-2005非洲猪瘟直接免疫荧光试验操作规程.docxVIP

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T1559.1—2005

非洲猪瘟直接免疫荧光试验操作规程

ProtocolofdirectimmunofluorescentassayforAfricanswinefever

2005-02-17发布

2005-07-01实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

I

SN/T1559.1—2005

前言

本标准参照了国际动物卫生组织(OIE)公布的《诊断试验和疫苗标准手册》(2004年版)关于非洲

猪瘟诊断中的免疫荧光抗体试验方法.

本标准的附录A为资料性附录。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：刘中勇、许如苏、游洪、周军。

本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。

SN/T1559.1—2005

非洲猪瘟直接免疫荧光试验操作规程

1范围

本标准规定了直接免疫荧光试验检测非洲猪瘟病毒的方法。

本标准适用于非洲猪瘟病毒的检测。

2仪器设备

2.1冷冻切片机。

2.2恒温培养箱。

2.3荧光显微镜。

2.4冰箱。

2.5leigton管(160mm×16mm)。

3试验材料

3.1非洲猪瘟标准毒株。

3.2非洲猪瘟荧光抗体：使用前用稀释液稀释至工作浓度。

3.3蒸馏水(pH7.4),配制方法参见附录A。

3.40.01mol/LpH7.4PBS(磷酸盐缓冲液),配制方法参见附录A。

3.5缓冲甘油：使用中性无自发荧光的甘油(分析纯)配制，配制方法参见附录A。

3.6丙酮：使用前置冰箱预冷。

3.7待检组织：无菌采取可疑病猪的脾脏、扁桃体、肾脏、淋巴结，置于尽可能的低温、但不能冻结的容器内运送、保存。

4操作方法

4.1待检组织制备

4.1.1组织切片、印片或涂片

将待检组织制成厚度为4μm～7μm的冰冻切片，也可制成印片或涂片。

4.1.2白细胞培养物涂片

4.1.2.1配制组织悬液

用组织研磨器或捣碎器将被检组织磨碎，加入0.01mol/LpH7.4PBS和抗菌素，配制成20%的组织悬液(每毫升组织悬液的抗菌素含量为：青霉素1000IU,链霉素1mg,庆大霉素50IU,制霉菌素

50IU),备用。

4.1.2.2制备白细胞

采取健康猪血，用玻璃珠脱纤或用肝素抗凝(每毫升猪血含肝素100IU),700g离心30min,吸出

血清或血浆备用。另外吸取白细胞，并用细胞基础培养液洗涤3次，备用。

4.1.2.3配制细胞培养液

用上述血清或血浆加细胞基础培养液配制成细胞培养液，使血清或血浆的终浓度为10%～30%。

2

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4.1.2.4培养白细胞

将白细胞悬浮于细胞培养液中，使细胞含量为107/mL。分装于160mm×16mm的leigton管中，

每管1.5mL,将试管与水平面成5°~10°倾斜放置，置于5%二氧化碳环境中，37℃培养2d～4d。

4.1.2.5接种

每份组织悬液接种3管白细胞培养物，每管接种0.2mL。置于5%CO?环境中，37℃培

养2d～4d。

取1管白细胞培养物接种非洲猪瘟标准毒株作阳性对照。

另取1管白细胞培养物不接种病毒作阴性对照。

4.1.2.6涂片

用已接种待检组织的白细胞培养物涂片，制成待检标本。

用阳性对照管的细胞培养物涂片，制成阳性对照标本。

用阴性对照管的细胞培养物涂片，制成阴性对照标本。

4.2固定

分别将上述标本在室温下自然风干，用预冷丙酮固定10min。

4.3漂洗

将上述标本分别用0.01mol/LpH7.4PBS漂洗3次，每次5min,最后用蒸馏水漂洗3min。

4.4加荧光抗体

在标本上滴加上作浓度的非洲猪瘟荧光抗体，然后将标本放入湿盒内，置于37℃恒温培养箱内温

育1h。

4.5漂洗

重复4.3,自然风干。

4.6镜检

于标本上滴加1滴缓冲甘油，置荧光显微镜下检查。

5结果判定

阴性对照的细胞无荧光产生，阳性对照的细胞出现荧光，则对照成立，可进行结果判定。

待检标本的细胞出现荧光的，判定阳性。

待检标本的细胞无荧光出现的，判定阴性。

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附录A

(资料性附录)

试剂配制

A.1pH7.4蒸馏水

用盐酸或氢氧化钠调蒸馏水的pH值至7.4。

A.20.01mol