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实验步骤

1.开始ELISA前一天，稀释包被抗体，取酶标板每孔加入100ul包被抗体溶液，4度过夜

2.使用前将所有试剂放置室温，强烈建议所有标准品和样品做复孔或三孔，各次检测均要

求做标准曲线

3.洗涤液不少于300ul洗板4次，并在吸水纸上拍干板子，后续洗涤液同此

4.为了阻断非特异性结合和减少背景，每孔加200ul样品稀释液

5.封板并在摇床上室温孵育1h

6.在上述期间，准备标准品稀释液和适当的样品稀释液（如必需）

7.标准品稀释：500pg/ml,250pg/ml,125pg/ml,62.5pg/ml,31.25pg/ml,15.6pg/ml,

7.8pg/ml和0pg/ml

8.如步骤3洗板4次

9.每孔加入100ul标准品稀释液和样品到对应孔，如有需要可对样品进行稀释

10.封板并在摇床上室温孵育2h

11.如步骤3洗板4次

12.每孔加入100ul已稀释的二抗，封板并在摇床上室温孵育1h

13.如步骤3洗板4次

14.每孔加入100ul稀释的HRP，封板并在摇床上室温孵育30min

15.如步骤3洗板5次，每次洗涤洗涤液浸泡30s至1min，有利于减少背景

16.每孔加入100ulTMB显色液，并在摇床孵育15-30min，阳性孔将变为淡蓝色，此步无需

封板

17.每孔加入100ul终止液终止反应，阳性孔将由蓝色变为黄色

18.终止反应半小时内测定OD值（450nm）

ELISA实验基本原理

基本原理

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzymelinkedimmunosorbentassay,

ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微

量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活

性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶

的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表

面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在

固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产

物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的

催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

方法类型和操作步骤

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原

或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，

可设计出各种不同类型的检测方法。

（一）双抗体夹心法

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：

（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。

（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，

形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时

固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性

或定量。

根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本

中的抗体。

（二）双位点一步法

在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固

相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点

一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显着提

高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。

在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本

中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标