大豆茎溃疡病菌检疫鉴定方法 编制说明.docx

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《大豆茎溃疡病菌检疫鉴定方法》编制说明

（征求意见稿）

一、工作简况

（一）任务来源

本项目是根据国家标准委[2022]17号文《国家标准委下达2022年第17批国家标准制修订计划》（计划项目编号T-469，标准项目名称《大豆茎溃疡病菌检疫鉴定方法》）进行制定，本标准为“全国植物检疫标准化技术委员会（TC271）的输出标准，主要起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国黄埔海关、中华人民共和国南京海关、中华人民共和国思茅海关、中华人民共和国宁波海关。主要起草人：吴品珊、雷荣、

陈吴健、张海鹏、李彬、周剑、孙夕雯、杨藜、段维军、华丽。

（二）制定背景

大豆茎溃疡病上世纪50年代和80年代在北美大豆产区造成严重损失，部分田块80%的植株受害，产量损失达50%，不少地区造成毁种，仅1983年，美国

因此病造成的损失估计为5900万美元。

大豆茎溃疡病菌分为大豆北方茎溃疡病菌（Diaporthecaulivora(Athow

Caldwell)Santos,VrandecicPhillips）和大豆南方茎溃疡病菌（Diaporthe

aspalathiE.Jansen,Castl.Crous），均为我国进境植物检疫有害生物。大豆北方茎溃疡是北美和南美等大豆主产国家上主要的病害，蔓延迅速危害严重，损失巨大，可随贸易的调运广泛传播。目前大豆北方茎溃疡分布于韩国、奥地利、保加利亚、克罗地亚、塞尔维亚、法国、意大利、俄罗斯、美国、加拿大、阿根廷、巴西、厄瓜多尔等地。大豆南方茎溃疡病最先于1973年在美国南部发现，随后在美国南部各州普遍发生，引起产量损失高达100％，南方茎溃疡现已遍布意大利、加纳、尼日利亚、坦桑尼亚、美国、阿根廷、巴西、巴拉圭，也可随贸易的调运广泛传播。二十一世纪以来我国每年都进口大量大豆，海关多年来曾多次截

获过大豆南北方茎溃疡病菌，目前病菌在我国没有分布。

目前我国有关大豆茎溃疡病菌检疫鉴定的标准只有两项行业标准，分别是

“SN／T1899-2007大豆茎溃疡病菌检疫鉴定方法”和“SN/T3399-2012大豆茎

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溃疡病菌检疫鉴定方法-TaqManMGB探针实时荧光PCR检测方法”，为2007年和2012年颁布，时间较久远。随着分子生物学新技术的发展、我国最新研究成果的进展、以及对更快速更灵敏的检疫鉴定方法的需求，中国检科院2021年将该有害生物列为国家十四五“生物安全关键技术研究重点专项”的研究物种，研究病菌的等温核酸RPA检测等快速检测方法，RPA（重组酶聚合酶扩增RecombinasePolymeraseAmplification）检测方法的检测时间更短、灵敏度更高，不需要复杂的仪器。项目组研发了快速精准的RPA/CRISPR-Cas12a分子检测新

技术，在国际学术期刊发表了论文，建立了完善的检测技术。

（三）工作过程

起草阶段：2023年1月～2023年12月标准起草小组成员开始论证各种检测方法的实验和研究，将前期收集的病菌的菌株、文献资料认真分析论证，重复验证分离培养、形态学特征和分类鉴定，核实筛选各种已发表和研制的分子特异性。多次试验后确定，选用准确和稳定的分离培养、常规PCR、实时荧光PCR、

RPA/CRISPR-Cas12a荧光和RPA荧光法检测方法，目前完成征求意见稿。

二、标准编制原则、主要内容及其确定依据

（一）编制原则

该标准立项后，起草组认真阅读了标准制定的一系列文件，对标准制定的格式、内容、术语表达方式等进行了深入的学习，并根据GB/T1.1-2009《标准化工作导则第一单元：标准的起草与表述规则第一部分：标准编写》的要求进行标

准起草。

（二）主要内容

本文件规定了大豆南北方茎溃疡病菌的分离培养、形态学鉴定、分子生物学鉴定方法。适用于出入境海关、大豆产区等大豆种子和植株中的大豆南北方茎溃

疡病菌的检疫鉴定以及田间检测监测。

1.筛选

挑选干瘪、弱小、畸形的可疑种子、以及夹带的植物残体豆荚、茎秆等。1%

次氯酸钠中表面消毒5min，25℃保湿培养或APDA上培养。

2.形态学鉴定

观察菌落性状，子囊、子囊孢子、分子孢子的形状及大小等特征。

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3.分子鉴定

CTAB方法或植物基因组提取试剂盒提取DNA。

经搜集和比较国内外多种方法和本项目组的研制方法，反复验证后，推荐选择常规PCR（许忠祥等，大豆南方茎溃疡病菌PCR检测方