实验四---还原糖和总糖的测定.pptVIP

一、目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、原理还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料小麦面粉；精密pH试纸。2．主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20mL×11（2）大离心管：50mL×2（3）烧杯：100mL×1（4）三角瓶：100mL×1（5）容量瓶：100mL×3（6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1（7）恒温水浴锅（8）沸水浴（9）离心机（10）扭力天平（11）分光光度计3．试剂（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将6.3gDNS和262mL2MNaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。（3）碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。（4）酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250mL70%乙醇中。（5）6MHCl和6MNaOH各100mL。四、操作步骤1．制作葡萄糖标准曲线取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0号管调零点，测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。表1葡萄糖标准曲线制作五、结果与计算：计算出7、8号管光密度值平均值和9、10管光密度值的的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。六、思考题3,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的?如何正确绘制和使用标准曲线?七、附注离心时对称位置的离心管必须配平。标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。**实验四还原糖和总糖的测定

——3,5-二硝基水杨酸比色法·在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。·由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。四、操作步骤1．制作葡萄糖标准曲线葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂摇匀,沸水浴加热5min反应液冷却至室温蒸馏水定容至20mL(混匀)540nm下测光密度值绘出标准曲线1.21.50.81.261.01.51.01.050.81.51.20.840.61.51.40.630.41.51.60.420.21.51.80.2101.5200光密度值（OD-540nm）葡萄糖含量（mg）DNS（mL）蒸馏水（mL）1mg/mL葡萄糖标准液（mL）管号2．样品中还原糖和总糖的测定（1）还原糖的提取3.00g食用面粉少量蒸馏水调成糊状,再加50mL蒸馏水50℃恒温水浴20min4000r/min下离心5min收集上清液重复一次,合并上清液定容为100