细胞分离与培养技术.ppt

细胞培养技术--细胞培养的一般过程每代贴附生长细胞的生长过程：游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）细胞培养技术--细胞培养的一般过程冻存及复苏:为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存，这对于维持一些特殊细胞株的遗传特性极为重要。现简要介绍深低温保存法(-70℃~-196℃)的特点。

细胞培养技术--细胞培养的一般过程细胞深低温保存的基本原理：在-70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。细胞培养技术--细胞培养的一般过程细胞深低温保存的基本方法：将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。?细胞培养技术--细胞培养的一般过程悬浮细胞的保存:

计数将要冻存的活细胞。细胞应该处于对数生长期。以大约200～400g离心5分钟沉淀细胞，使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞；

以1×107到5×107细胞/ml密度，在包含有血清的冷冻培养基（DMSO终浓度为5-10%）中再次悬浮细胞，或者以0.5×107到1×107在无血清冷冻培养基中，再次悬浮细胞；

分装进冻存管，将冻存管置于湿冰上或放入4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤；细胞培养技术--细胞培养的一般过程传统方法：程序降温：可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，细胞以-1℃/分钟进行冷冻，然后转移到液氮中贮存。冻存管置于4℃10分钟-20℃30分钟-80℃16-18小时液氮罐长期储存细胞培养技术--细胞培养的一般过程贴壁细胞的保存:

使用分离试剂从基层分离细胞，分离时尽可能温和，使对细胞的损伤减少到最小；

在完全生长培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力细胞数；

以大约200g离心5分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞；

以5×106到1×106细胞/ml密度，在冻存液中悬浮细胞；分装进冻存管，按前述步骤冻存。细胞培养技术--细胞培养的一般过程冻存细胞的复苏:冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长培养基中。若细胞对冻存剂（DMSO或甘油）敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中。

细胞培养技术--细胞培养的一般过程直接铺板法:

取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化；

直接用完全生长培养基铺板细胞。1ml冻存细胞使用10~20ml完全生长培养基。进行活细胞计数，细胞接种应该至少在3×105活细胞/ml；

培养细胞12~24小时，更换新鲜的完全生长培养基，去除冻存剂。细胞培养技术--细胞培养的一般过程离心法:

取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化；

把1-2ml冻存细胞加入到大约25ml完全生长培养基，轻轻混匀；

以大约1000rpm离心2-3分钟，弃去上清；

在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞计数；

细胞铺板，细胞接种应该至少为3×105活细胞/ml。细胞培养技术--细胞培养的一般过程冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。?细胞培养技术--细胞培养的一般过程常用仪器设备:?无菌室培养器具无菌过滤器超净工作台CO2培养箱洗刷装置三重纯水蒸馏器恒温水浴锅细胞计数板抽气泵倒置显微镜电子细胞技术仪压力蒸气消毒器离心机电热恒温培养箱?细胞培养技术四细胞培养的无菌环境?1、无菌室?

无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。?

无菌室的消毒和防污染：为保持无菌状态，经常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（1－2小时），每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。实际工作中