Folin酚试剂法分析和总结.docx

[原理]

实验（四）蛋白质浓度测定——Folin-酚试剂法

实验室常规测定蛋白质含量方法中，以Lorry等人发展的Folin-酚试剂法应用最为普遍。该方法的优点是：灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10～20倍，双缩脲法灵敏100倍；操作简单快速，不需要复杂的仪器设备。但它的不足之处是反应过程中受干扰因素较多。

Folin-酚试剂由试剂A和试剂B两部分组成。在Folin-酚试剂法中，蛋白质中的肽键首先在碱性条件下与酒石酸钾钠-铜盐溶液（试剂A）起作用生成紫色络合物（类似双缩脲反应）。由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸的存在，该络合物在碱性条件下进而与试剂B（磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成）形成蓝色复合物，其呈色反应颜色深浅与蛋白质含量成正比。

通过比色测定，参照已知含量的标准蛋白质的标准曲线，可确定待测样品的蛋白质含量。本法可测定蛋白质含量的范围在25～250μg/mL。

由于不同蛋白质所含酪氨酸和色氨酸残基的量不同，致使等量的不同蛋白质所显示的颜色深度不尽一致，产生误差。如果所用溶液或样品中含有带“ -CO-NH2”、“-CH2-NH2”、“-CS-NH2”基团的化合物，或者溶液或样品中含有氨基酸、Tris、核酸、蔗糖、硫酸铵、巯基及酚类等化合物时，会给本方法的测定带来干扰。

磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin-酚试剂B）仅在酸性条件下稳定，而蛋白质的显色反应需在pH10的环境中进行，因此当试剂B加入后应当立即充分混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前与蛋白质发生显色反应，这对于结果的重现性非常重要。

[方法与步骤]

1、标准曲线的绘制

取六支试管，标明编号（0～5），放置在试管架上，在试管内分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准酪蛋白溶液，用蒸馏水补足至每管总体积1.0mL。再加入新配制的试剂A5.0mL，充分混合，在室温下放置10min。各管中加入0.5mL试剂B，立即摇匀，然后在室温下放置30min。以零号管作空白对照，在660nm波长下比色测定。

以标准蛋白毫克数为横坐标，A660值为纵坐标绘制标准曲线。

2、未知蛋白浓度的测定

方法与步骤与上述第5管相同，用1.0mL未知浓度蛋白溶液代替标准蛋白溶液。未知浓度蛋白测定应与标准曲线制作过程同步进行。

根据未知浓度蛋白溶液的A660值，运用标准曲线图，查得所对应的蛋白毫克数，计算蛋白溶液的浓度（μg/mL）。实验（五）考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量

[原理]

度很高，可测微克级蛋白质含量。

[方法与步骤]

1、标准曲线绘制

考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质 -染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定

595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右

的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏

管号取6支试管，按下表加入各试剂。

管号

0

1

2

3

4

5

试剂

100μg/ml牛血清白蛋白溶液／mL

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

蒸馏水／mL

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0

考马斯亮蓝液／mL

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定，

记录A

。

595

以各管相应标准蛋白质含量（g）为横坐标、A

2、样品测定

595

为纵坐标，绘制标准曲线。

试管中加自制蛋白质样品1.0mL，再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置

5min后，在595nm波长下比色，记录A

。

595

根据所测A

注意事项

595

从标准曲线上查得蛋白质含量。

（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。比色反应需在1h内完成。

（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，

是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。