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各种组织冰冻切片、取材，染色等具体操作方法(连载一脑、肠、眼球）

做脑组织的冰冻切片在前期的处理过程中很重要，因为脑组织非常软。不但要做前固定，最好是做全身灌注固定后，如果不做全身灌注固定，很难取出一个完整的大脑组织。再段头取脑置4度4％多聚甲醛（或西奈山环保组织固定液）中后固定24小时，然后依次置入剃度PB蔗糖溶液脱水，剃度可以设为15%，20%，30%分别过夜沉底即可。设剃度脱水是为了避免组织块冰晶的产生。冰晶在组织片上表现为圆形或椭圆行的空洞，影响实验结果。在做切片时可以做简单的HE染色即可分辨出是否有冰晶。防止冰晶的另一实验注意点是在做切片前的包埋过程，要求速冻，一般放-20度下15分钟即可，温度高如室温或者4度是达不到速洞效果的，温度太低如放在液氮罐中又导致组织块的碎裂。而且产生冰晶。

如果想要作出满意的漂亮的实验结果，特别是免疫双标共聚焦，那就要求更高，实验的每一步都要很严格，不是我说法夸张，是因为做共聚焦要避免自发荧光的问题，而实验的每一步都可能产生自发荧光，比如4％多聚甲醛灌注液，PB蔗糖等都可以产生让我们头痛的自发荧光问题，根据我的实验经验，国产的多聚甲醛作实验很容易产生自发荧光，难以避免，不过据我导师讲，他在国外做共聚焦不存在这些问题，所以我个人认为你不妨先做单标试试看，能避免自发荧光，那最大的难题就解决了。西奈山环保组织固定液可以降低自发荧光背景。3.是否做漂片还是贴片的问题，脑组织两种方法都可以，唯独共聚焦例外，做共聚焦要求片子一般为 30-50um，厚片才能达到三维重建的效果。一般的贴片文献上提到的是

20-30um用漂片，此法要求抗体用量较大，最好买国外原装的浓缩液。不过我做的脑片切过

4um的做一般的普通免疫荧光可以。

楼上的几位同仁说得不错。就我们实验室的操作方法以及个人的体会说上几点：

1.如果灌注固定较好的话，完全可以省去后固定这个步骤。神经组织常规的固定液为4%的多聚甲醛，如果在其中再加入0.25-0.5%的戊二醛增加其固定时的交联作用，那么固定的效果就会更好些，脑或脊髓标本就会更硬些；我们一般用1000ml多聚甲醛固定至少2小时。不妨试试西奈山环保组织固定液。2.冰冻时的温度我们一般设置在－18摄氏度，效果较好。3.脱水也是重要的一步：首先在多聚甲醛固定后用20%的PB蔗糖液400ml灌注脱水，取材后再用30%PB蔗糖液浸泡脱水过夜或更长些时间即可。

做脑组织冰冻切片,一般切片前需要固定,经过固定的脑组织切片冰晶少,细胞挤压变形小,切片完整,染色清晰,未固定的组织冰晶多,会影响观察结果.切完后,看你是做漂片还是贴片,一般脑组织贴片难度较大,多用漂片,切完需马上漂洗后,按常规染色步骤进行.最后,以中性树脂封片,若是HE染色或DAB染色,切片可以放置很久,甚至数年时间.

脑的冰冻切片最好是4％多聚甲醛（西奈山环保组织固定液）灌注，再后固定24h，30%PB蔗糖浸至沉底。切片效果不错，可以贴片，不过技术要求高一些。BrdU,Nestin双标有一些窍门，

BrdU博士德有进口分装,Nestin很多公司都有进口分装

灌注固定的效果之所以好，就是因为这种方法可以通过血管走行把固定液输送到动物全身各处，从而达到最佳的固定效果；同样，用该方法进行脱水也可得到较好的脱水效果，因为这种方法可在组织深部进行脱水，再结合取材后30%的PB蔗糖液浸泡脱水，会得到更好的脱水效果。而浸泡脱水只能从组织的外部通过渗透压逐步把组织深部的水脱出。

其实，条条大路通罗马，只要你习惯了一种可靠方法即可。

脂肪组织的处理

脂肪组织无疑是冰冻切片者的绊脚石，道理很简单脂肪不会结冰，把温度降低让脂肪变硬可以切出较薄的片子，但是这个温度对同一组织中的其他成分来说显得太低而不合适切片，当脂肪破碎影响切片时这个问题就变得明显，下面是一些我的经验总结。

尽可能的削掉不需要的脂肪组织

当我准备切淋巴结时，我会先检查一遍，小心翼翼地除掉表面及髓内的脂肪，结内的脂肪用解剖刀刮擦掉，被膜线附近的脂肪用刀切除，这样就不需要切开整个淋巴结被膜。有人会说，我把一些组织去掉后，可能导致漏判一些阳性的淋巴结，但我的经验是好的干净的片子比含有太多脂肪的差片子更容易获得阳性的结果。当你在休整组织或切片的过程中脂肪组织意外出现时，你也可以使用前面的挖凿技术。

调整组织块的方向使脂肪最后接触刀片

切片时尽量避免脂肪先接触刀片，因为脂肪会脱离包埋物，在切片上留下一个洞，如果不能避免，也要在其周围加上包埋物，让包埋物先接触刀片。

保证刀片、台面的干净及组织块的冷冻程度

切片机的台面和刀片必须保持干净，假如你弄碎了一张片子必须即时用一块干纱布清理