鸡胚法病毒分离培养作业指导书.pdfVIP

作业指导书编号：TYCDCQTDOC0012018

病毒分离培养（鸡胚法）版本：第一版第0次修改

颁布日期：2018—11—12

1.目的

规范本中心分离和鉴定各型流感病毒的操作方法，确保结果准确、可靠和实验室生物安全。

2.依据标准

《流行性感冒诊断标准》WS285-2008附录A仅限A1，A2.1,附录G

《全国流感监测技术指南》附件1一、四、五

3.适用范围适用于各型流感病毒的分离和鉴定

4.实验室生物安全级别及个人防护

对采集自属于感染流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在

BSL-2实验室内进行，并遵循生物安全二级个人防护。在特殊情况下（如新型流感病毒的分离培

养工作等），应根据实际情况调整实验室生物安全级别及个人防护级别。

5.标本的采集、处理和储存

5.1推荐采集的呼吸道标本种类及拭子的选择

发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。气管插管的病人

也应收集气管吸取物。标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4℃冰箱，

并马上送至实验室。

标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。不推荐棉拭子和

木柄。标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生

素，缓冲液）。

5.2标本处理

实验操作人员在处理流感样病例标本时必须在BSL-2实验室的生物安全柜中进行。标本在实

验室内/间转运时需有双层防护包装。标本在离开生物安全柜前，应使用75%酒精或新鲜配制的

含氯消毒液（有效氯含量2000mg/L）对容器表面进行消毒。

收到标本后，应尽快处理并进行分离，避免反复冻融。按标本类型不同分别处理：鼻、咽

拭子标本应将管内拭子在管壁反复挤压后，弃去拭子；鼻腔、气管吸取物标本应用干净灭菌的

毛细吸管反复吹打，以便打碎粘液；鼻腔或咽部冲洗液标本应充分振荡标本管，将粘液打碎。

咽拭子在进行挤压时，动作要轻柔勿剧烈操作，以防止产生气溶胶和液体溅出。处理前将合适

尺寸的纱布在新鲜配制的含氯消毒液（有效氯含量1000mg/L）中浸泡并拧干，平铺于生物安全

柜内操作区。

标本经以上处理后置4℃，待其自然沉淀5～10分钟，取上清液直接接种或低温保存。如采样液

中未加抗菌素，接种前应补加庆大霉素终浓度为0.1mg/ml，抗真菌药物终浓度为2mg/ml。混匀

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作业指导书编号：TYCDCQTDOC0012018

病毒分离培养（鸡胚法）版本：第一版第0次修改

颁布日期：2018—11—12

置4℃过夜或室温作用2～4小时即可接种。

5.3标本保存

24小时内能进行接种的样本可置于4℃保存；如未能接种，应置-70℃或以下保存。不应保

存在-20℃。

6.流感病毒的分离程序

6.1鸡胚分离程序

流感病毒的鸡胚分离实验室生物安全级别：BSL-2，实验操作人员需进行BSL-2级防护。流

感病毒的鸡胚接种和病毒培养液的收获操作必须在上述级别实验室的生物安全柜中进行。

6.1.1试验材料的准备：

9～11日龄SPF鸡胚

照卵灯

70%～75％酒精

一次性1ml注射器，22号针头

鸡卵开孔器

胶水或医用胶布

15mL无菌离心管、试管架

10mL无菌移液管

无菌镊子

6.1.2验卵

1）用照卵灯检测鸡胚，标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎的位置。如果鸡胚是死胚、

没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉。

2）如何判断鸡胚状态

血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带或淤血块

胎动：活胚有明显的自然运动，死胚