细胞培养的操作流程.pdfVIP

实验题目：细胞传代

实验材料：细胞培养箱，安全柜，手套，酒精灯，吸管，移液管（5ml，10ml），50mL离心

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管，培养瓶（25cm），移液枪，离心机，计时器，真空泵，抽滤瓶，水浴锅，

记号笔，冰箱

实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也

将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。

传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种

实验的必经过程。

实验步骤：以Hela细胞为例说明具体实验操作步骤

一．实验前准备工作：

进细胞室先换拖鞋，带上手套75%的酒精进行表面消毒；

检查酒精灯有无95%酒精，电枪有无电；

将实验过程中用到的实验器材（包括培养瓶、50mL离心管、移液管）放于安全柜里，实验

前安全柜开紫外照15~20min；

将细胞培养液放于37℃水浴中预热；

抽滤瓶与真空泵相连，废弃缸套袋。

二．.准备实验：

先关闭紫外等30min后再进行实验；

75%酒精喷于纸上，将超净工作台仔细擦试干净；

点燃酒精灯，小心的将细胞从孵箱中拿出。

1．吸除旧的DMEM培养液：

拿出吸管（要拿吸管的上端），插入与抽滤瓶相连的橡胶管中，在酒精灯外焰灼烧灭菌，细

胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角，吸出旧的DMEM培养液，将用后的吸管弃于废弃缸

里。注意：一定要吸除干净，否则消化时间过长，细胞损伤过大。

2．消化：

拿出5mL移液管，插入电枪中，酒精灯过火灼烧，吸取2mL0.25%胰酶加入培养瓶中，混

匀，放于37℃孵箱中消化5-6min。

取下用后的移液管。

3．中和：

从孵箱中拿出培养瓶，显微镜下观察细胞是否被完全消化下来，5mL灭菌后移液管加入3mL

DMEM培养液终止消化。

反复吹打混匀；吸出中和液转移到50mL离心管中。

4．离心收集细胞：

配平后离心200×g，3min。将新的DMEM培养液加入新培养瓶中，2mL／瓶（培养瓶底面

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积为25cm）。

5．重悬细胞：

离心后吸出中和液，（先吸出表面泡沫，一定注意不要吸出细胞）。加入新DMEM培养液（按

2mL／瓶和细胞传代数计算加入的培养液体积），用电枪反复吹打使细胞充分混匀，要尽量

减少产生气泡。

6.分装：

混匀后将细胞分装，按2mL/瓶得体积加入培养瓶中，充分混匀。记号笔标记细胞名称，培

养液，细胞传代数，传代日期，实验人员。

7．培养：

将细胞放于37℃,4%CO2细胞培养箱培养。将0.25%胰酶，细胞培养液密封好放于4℃冰箱

中保存。

8．清洁安全柜

实验完毕后，盖灭酒精灯，关闭真空泵，用酒精棉球擦干净操作台表面。

9．观察：

每天观察细胞，并记录细胞生长状态。

实验注意事项：

1．紫外消毒过程中会产生臭氧分子，对人体有害。一般情况下，消毒后至少半小时后再进

入。

2．所有的实验器材都要经过消毒处理；所有的细胞操作都在安全柜中进行，每一步都要注

意不能用手碰到瓶口，培养液不能碰到瓶口，拿培养瓶时要使培养瓶的瓶口微微翘起。

3．细胞消化时间不能太长，要让细胞尽快脱离不舒服的环境；离心时离心机转速不能太高，

实验前要设定好离心转速和时间；重悬细胞时要保证细胞完全混匀，在显微镜下观察细胞是

一个一个的。

4．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火

焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。

5．每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生

长致密时即可传代。

实验题目：细胞复苏

实验原理：细胞复苏的原则－快速融化：

必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅

速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

实验材料：水浴锅，安全柜，冻存细胞，细胞冻存管，培养瓶，移液枪，移液管（5ml，10ml），

DMEM细胞培养液，细胞培养箱

实验操作:

一.实验前准备：

1.将水浴锅预热至37℃

2.用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。

3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶。

二．取出冻存管：

1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞