第三章-植物细胞培养.ppt

35第三章植物细胞培养;

;;机械法的特点：⑴细胞不受酶的伤害；⑵不发生质壁分离。

使用此方法分离叶肉细胞，材料要求是薄壁细胞、组织排列松散。

2.酶解法利用果胶酶使细胞间的中胶层发生降解，分离出具有代谢活性的细胞的技术。

Takebe等(1968)以烟草叶片为材料：

撕去下表皮后，将撕去下表皮的叶片切成4cm2的小块。放入经过过滤灭菌的酶溶液中（含0.5%果胶酶，0.8%甘露醇和1%硫酸葡聚糖钾），真空抽气后，在摇床上保温培养，每30min更换一次酶液。将第一个30min后换出的酶液弃掉，第二个30min后的酶液中主要分离海绵细胞，第三和第四个以后主要分离栅栏细胞。

酶解法的特点：能得到比较均匀一致的海绵组织细胞或栅栏组织细胞。但在使用该法分离细胞时，必须对酶溶液给予渗透压保护，防止细胞的胀裂。;3.由培养的愈伤组织中分离单细胞

首先通过固体培养诱导外植体脱分化,把未分化和易散碎的愈伤组织转移到装有液体培养基的三角瓶内，将这些悬浮培养物在摇床上进行振荡培养，并得到游离细胞。

振荡的作用：

⑴对细胞团施加一定的缓和压力，使之破碎成小细胞团或单细胞。

⑵促进培养基和容器内空气之间的气体交换，保证细胞正常的呼吸代谢。

（二）单细胞培养方法

1.平板培养法（platecultivationmethod）

将悬浮培养的细胞接种到未固化的薄层培养基中进行培养的过程。

;单细胞的获得：

先将含有游离细胞和细胞团的悬浮培养物过滤除去较大的细胞团，留下游离的单细胞和小细胞团，从而得到单细胞无性系。

细胞记数：

过滤的悬浮培养材料先进行细胞计数，使悬浮培养液达到要求的细胞培养密度。

细胞培养：

将0.6%～1%琼脂的培养基灭菌后，冷却到35℃，在恒温水浴中，将细胞悬浮液接种进去，充分混合后倒入培养皿中。当培养基凝固后，细胞均匀分布并固定在约1mm厚的培养基中在25℃暗条件下培养，20d后再计数每只培养皿中出现细胞团的数目。

每个平板上形成的细胞团数

植板效率=x100%

每个平板上接种的细胞总数

;2.看护培养法??nursecultivationmethod）

用同种或异种材料的愈伤组织作为看护组织来培养细胞的一种方法。

Muir等（1954）设计：把单细胞放在一块活跃生长的愈伤组织上进行培养，在愈伤组织和培养的细胞之间有一片滤纸相隔。

特点：看护愈伤组织可给单细胞的生长与分裂提供培养基的营养成分，而且活跃生长的愈伤组织所分泌的代谢产物，为单细胞的分裂提供一些活性物质。直接接种在培养基上不能分裂的离体单个细胞，在看护愈伤组织的影响下就可能发生分裂。;3.微室培养（Microculture）;;二、细胞的悬浮培养

悬浮培养(suspensionculture):

指一种在受到不断搅动或摇动的液体培养基里,培养单细胞以及小细胞团的组织培养系统。在单细胞培养的基础上，得到优良的遗传基础稳定的单细胞无性系扩大培养。20世纪50年代以来,从试管的悬浮培养发展到大容量的发酵罐培养。

优点：可提供大量比较均匀一致的植物细胞；细胞增殖的速度比愈伤组织快；适宜大规模工业化培养。

（一）悬浮培养的方法

分为三种:分批、半连续、连续培养;1、分批培养（batchculture）

指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，建立单细胞培养物的培养方式。

除了气体和挥发性代谢产物可以与外界环境交换之外，其他条件密闭。当培养基中的主要成分耗尽时，细胞的分裂和生长停止。因此，为了使分批培养的细胞不断增殖，需要进行继代培养。

细胞数目的变化曲线：

从培养开始起到细胞增长

停止的整个生长周期中，

细胞数目增加的变化大致

呈“S”型曲线。;①延滞期(lagphase)：

细胞很少分裂，细胞数目增加少。

②对数生长期(logarithmicphase)：细胞分裂活跃，数目迅速增加。

③直线生长期(linearphase)：

细胞增殖最快时期，单位时间内细胞数目增长大致恒定,细胞数目达到最高峰。

④缓慢期(retardphase)：

培养基中某些营养物耗尽，或是有毒代谢物的积累，增长速度逐渐变慢。

⑤静止期(stationaryphase)：

生长趋于完全停止。;2.半连续培养

利用培养罐进行大量细胞培养的一种方式。

当培养罐内细胞数目增殖达到一定数量后，将1/2的细胞悬浮液倒于另一个培养罐中，分别添加新鲜培养基继续进行培养。

该培养方法能重复地获得大