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小鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察

一、【实验目的】

掌握线粒体的超活染色原理及方法。

观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。

二、【实验原理】1．线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿B是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。不同细胞中线粒体的形态和数目不同。在电子显微镜下，线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。

线粒体的细胞色素氧化酶能使詹纳新绿染料始终保持在氧化状态而呈蓝色，周围细胞内的染料却被还原成无色的色基，在进行细胞的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染料中染色15min后再盖上盖玻片，以使材料充分氧化。2．活体染色是指用燃料标记生活有机体的细胞或组织但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示活细胞内的某些结构，同时即不影响细胞的生命活动也不会产生任何物理、化学变化导致细胞的死亡。活染技术可用来研宄生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起作用。碱性燃料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子；而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们被此就发生了吸引作用。但不是任何染料都可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料配成稀的溶液来使用。一般以碱性染料最为常用，因为碱性染料具有溶解在类脂质的特性，易于被细胞吸收，如中性红、詹钠斯绿、次甲基蓝、甲苯胺蓝、亮焦油紫等。其中詹钠斯绿和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最常用的染料，分别对线粒体和液泡系有特异性的染色。詹纳斯绿B这种碱性染料是活体染色中重要的材料，对线粒体的染色有专一性，可专一性地对线粒体进行活染，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原成无色的色基。

三、【实验材料】

器材：小白鼠，解剖盘，镊子，剪刀，载玻片，盖玻片，滴管，双凹片，小烧杯，显微镜；

试剂：1/500詹纳绿B染液；Ringer试剂

四、【操作步骤】1．用断头法处死小白鼠，置于解剖盘中。剪开腹腔，取出肝脏，选取边缘较薄的肝组织0.5cm3，放入小烧杯中，用Ringer液冲洗去血污。

滴加1/500詹纳绿B溶液于双凹片的凹穴中，再将上述洗净的肝组织移入染液中，染色20—30min。以组织块边缘被染成蓝绿色为准。

吸去染液，将肝组织重置小烧杯中，滴加Ringer溶液0.5ml，用剪刀将组织充分剪碎制成悬液。4．取上述细胞悬液滴片，加上盖玻片，在高倍镜下观察。

五、【试验结果】

小鼠肝细胞质中的线粒体被染成蓝绿色（理想状态下）。

小鼠肝细胞线粒体的超活染色（10x40）六、【注意事项】

在从小鼠体内取肝组织块时要尽量快，从而能够保证它更高的活性。

染色时要使组织块上面部分半露在染液外，不可完全淹没，以便使线粒体酶系得到氧化。3．在选取肝组织片时要在处于边缘，且为由薄到厚的地方选取。

4．染色结束后，加入的Ringer液的量不能太多，只需要刚盖过肝组织块即可。如果量太多，则在剪组织块的时候会造成其上浮，从而不易剪碎。5．观察前要将肝组织充分剪碎，制片时要吸取上悬液，使游离的细胞或细胞群留在载玻片上，而要避免吸取稍大的组织块

七、【结果分析与讨论】1．在理想状态下，小鼠肝细胞质中的线粒体应该被染成蓝绿色，但是在实际观察中，线粒体呈浅绿色甚至无色。可能原因有：1.染色时间不够，使染色不够充分。2.肝组织块剪得太大太厚了，使得染料透过速度太慢，最终使得大部分的细胞未染上色。3.根据实验原理要求，染色剂的浓度要求极稀。这本身就让染色过程具有了一定难度。