青椒中转基因成分定性PCR检测方法.docxVIP

SN/T2271—2009

前言

本标准由国家认证认可监督委员会提出并归口。

本标准起草单位；中华人民共和国山东出入境检验检疫局。

本标准主要起草人；高宏伟、梁成珠，刘心同、王岩、于立欣、曹患雷。

本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。

SN/T2271—2009

青椒中转基因成分定性PCR检测方法

1范围

本标准规定了转基因青椒中外源基因CaMV35S、NPTⅡ、NOS,CMV定性PCR检测方法。本标准适用于对青椒样品的转基因筛选检测，适用于抗黄瓜花叶病毒转基因青椒的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

SN/T1193基因检验实验室技术要求

SN/T1204植物及其加工品中转基因成分实时荧光PCR检测方法

3术语，定义和缩略语

下列术语、定义和缩略语适用于本标准。

3.1术语和定义

3.1.1

转基因transgene

将本物种不具有的，来源于其他物种的功能DNA序列，通过各种导入手段，使其在该物种中进行

表达，以便使该物种获得新的品种特征。

3.1.2

聚合酶链反应polymerasechainreaction,PCR

模板基因序列先经过高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别于模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的催化下以四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性，退火和廷伸这一循环，使欲扩增的基因片段呈几何倍数扩增。

3.2缩略语

3.2.1

rheL.ribulosebisphosphatecarboxylase/osygenaseLargesubunit

核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基基因，由植物叶绿体基因组编码。

3.2.2

CaMV35835promoterfromcauliflomermosalevirus

花椰菜花叶病毒35S启动子。

3.2.3

NPTImeomycinphosphotransferase-Ⅱ

新霉素-3*-磷酸转移酶。

3.2.4

NOSnopalinesynthaseterminator

胭脂碱合成醇3’转录终止子。

2

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3.2.5

CMVcucumbermosaievirus

黄瓜花叶病毒。

4原理

样品经过提取DNA后，针对转基因植物所插人的外源基因的基因序列设计引物，通过PCR技术，特异性扩增外源基因的DNA片段，根据PCR扩增结果，判断该样品中是否含有该转基因成分。

检测先对提取的DNA进行内对照的扩增，扩出相应的内对照条带后可以进行筛选基因的检测，如果筛选基因为阳性，再进行鉴定基因的检测。如果筛选基因为阴性则直接报告结果。

检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193中的规定执行。

5试剂

5.1PCR用引物

按照表1中提供的引物序列合成引物，加入无离子水配成100pmol/pL.贮存，配成直接用于PCR反应的10pmol/pL.的工作液。

表1转基因青椒PCR检测用的引物序列及PCR产物的大小

5.2药品及试剂

TagDNA聚合酶，琼脂糖(电泳纯)溴化乙锭，三氯甲烷，异丙醇，70%乙醇，分子量标准(100bp~

2000bp).RNaseA酶，Tris饱和酚，UNG酶，

TE缓冲液：10mmol/LTrisHCl(pH8.0),1mmel/L10×PCR缓冲液：100mmol/1.氯化钾，160mmol/L

EDTA(pH8.0)。

碳酸铵[(NH?),SO,],20

mmol/I.硫酸镁

(Mg5O?),200mmol/L电泳缓冲液：Tris

Tris-HCl(pH8,8),1%Triton54g.硼酸27.5g,0.5mol/L

X-100,1mg/mL.BSA。EDTA+TrisHCl(pH8.0)20

mL.加蒸馏