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葡萄苦腐病菌检疫鉴定方法
SN/T2614—2010
附录B
(规范性附录)
分子生物学鉴定
B.1DNA提取方法
样本为植物组织时，将植物组织洗净消毒后切成小块，冷冻加液氮研磨，放入1.5mL.离心管中待用。样本为真菌时，收集菌丝放入1.5mL.浸在液氮里的离心管中，用塑料杵碾碎待用。
离心管加入300μl～500μL.CTAB缓冲液(其中含0.1g蛋白醇K)混匀，65℃水浴1h;13000g离心5min～10min,保留上清液；加500pl.Tris饱和酚：三氯甲烷：异戊醇(体积为25:24:1)混匀，13000g离心5min~10min,保留上清液；再加500yl.三氯甲烷1异戊醇(体积为2411)混匀，13000g离心5min～10min.保留上清液；加入1mL异丙醇混匀，-70℃下放置1h.或-20℃过夜；13000g离心30min,可见DNA沉淀；70%乙醇洗DNA沉淀，室温干燥；用30pL~50μLTrisEDTA缓冲液溶解DNA,待用。
B.2常规PCR检测
特异性引物GUA-1序列为5-GTGGCCCTGTAAACTCTTGT-3,GUA-2
序列为5-GGC-
CGCTAAGTCAACCTAAG-3.
25pl.反应体系中含：样品DNA1pL(1ng~50ng)。10×PCRbuffer
2.5gl,25mmol/1.氯化钱
2pL.2.5mmol/LdNTps2pl.10μmol/L.Primers0.5pL/0.5pL.5U/gl.TagDNApoLymerase
0.2pL.ddH?O16.3pL。同时要设置阴性对照，以Tris-EDTA缓冲液代替DNA样品。
PCR反应条件为：预变性，94℃5min→变性，94℃1min.退火53℃30s,72℃45s,35个循环→
72℃10min→4℃保存。
PCR产物的检测在1XTAE电泳缓冲液中，1.5%琼脂糖凝胶电泳，5V/cm,0.5%EB染色20min,
凝胶成像仪分析结果。
B.3实时黄光PCR检测
实时荧光PCR引物序列为GUA-P1:TCGCGGCTGGAGAAGG,GUA-P2:TCGATGCCAGAAC-
CAAGAGAT,TagMan探针GUA-Probe-117:5°-FAM-TGCCGGTGGCCCTGTAAACTCTTGT-
TAMRA-3。探针5端标记的英光报告基团为FAM,3”端标记的荧光猝灭基团为TAMRA。
25pL反应体系中含；样品DNA1pl,10×PCRbuffer2.5pl,25mmol/L氯化镁2μL.
2.5mmol/LdNTps2pl.,10pmol/L.PrimersIyL/1yL.,10gmel/L探针Probe-1171.5yL..5U/yl.
TagDNApolymerase0.3pl,ddH;O12.7pL。
反应循环为94℃10min→94℃15%,60℃60s循环40次。
SN/T2614—2010
附录C
(规范性附录)
病菌形态图
图C.1分生孢子盘，线长=6μm(采自高清文，1990)
图C.2分生孢子梗及分生孢子，线长=2μm(采自高清文，1990)
SN/T2614—2010
SN/T2614—2010
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