《预防医学实验》菌落总数的测定和大肠菌群的测定.ppt

***************地表水及生活饮用水菌落总数和大肠菌群的测定指示微生物的检测指示微生物：是指在常规卫生监测中，用以指示样品卫生状况及安全性的（非致病）微生物（或细菌）最常用的指标为菌落总数和大肠菌群菌落总数：1mL水样在普通营养琼脂培养基中，经37℃24h*培养后，所生长的细菌菌落的总数。GB5749-2006：生活饮用水菌落总数（CFU/mL）≤100*GB5749-2006定义为48h*大肠菌群：一群能在35～37℃、24h内发酵乳糖产酸产气的、需氧或兼性厌氧的，革兰阴性无芽孢杆菌。水样中总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在。大肠菌群主要包括肠杆菌科的大肠埃希氏菌属、枸橼酸菌属、肠杆菌属(产气杆菌属)、克雷伯氏菌。根据对培养温度的敏感性分为：总大肠菌群（35～37℃）和粪大肠菌群（44～45℃）GB5749-2006：生活饮用水总大肠菌群（MPN/100mL或CFU/100mL）不得检出*水样的采集及送检参见GB5749-20061.采样器皿的准备：采样瓶洗净，瓶口包扎进行灭菌，装运和保存过程中避免污染2.采自来水样时水龙头酒精灯烧灼消毒，放水5～10min，常用的水1～3min。目的：排除管道内贮存水样。采样量为瓶的80%左右，方便摇动混匀水样3.如果采集的水样含有余氯，则在采样瓶未灭菌前，按每500mL水样加入1.5%硫代硫酸钠（Na2S2O3）2mL。4.采集江、河、湖、水库等地表水时，应选择有代表性的地点及水质可疑的地方。深度：距水面10～15cm。5.采样后，应立即记录名称、时间、地点等项目。从速检测。一般从采样到检测不超过2h，条件有限时，先存放冰箱，但也不应超过4h。*实验目的学习生活饮用水的取样方法掌握测定菌落总数的方法。学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法；了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性仪器设备和试剂恒温培养箱显微镜无菌吸管无菌平皿营养琼脂量筒无菌水3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液伊红美蓝平板普通浓度乳糖蛋白胨培养液革兰染色液本次试验所用水样为：实验室自来水中山公园地表水*一、生活饮用水由于生活用水较清洁，故无需稀释处理1.用力摇匀20～25次，使细菌分散2.细菌总数及大肠菌群的检测步骤方法及步骤实验原理菌落总数的测定采用平板掺入法发酵法测定大肠菌群包括：初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验。初（步）发酵试验：利用大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气的原理。平板分离：采用伊红美蓝琼脂平板，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色菌落。复发酵试验：以上阳性菌落，经染色为革兰氏阴性无芽孢菌者，再次进行发酵试验，经24h培养产酸产气的，最终确定为大肠菌群阳性结果*5mL3倍浓缩乳糖蛋白胨×250mL3倍浓缩乳糖蛋白胨水样各取100mL×10各取10mL1mL45℃营养琼脂20mL旋转混匀①②37℃，24h菌落总数大肠菌群每个水样做两皿平行对照，另取一皿做空白对照注：平行对照主要是为了排除由于操作带来的影响空白对照主要用来排除由培养基等带来的影响

45℃以手背皮肤能忍受的温度为准*培养24h后观察结果若大肠菌群的培养管产酸产气则按以下步骤进行伊红美蓝培养基取产酸产气的培养液37℃，24h挑取菌落革兰染色镜检，复发酵37℃，24h10mL普通浓度乳糖蛋白胨培养液*二、地表水由于地表水所含细菌量较大，故测定前常进行稀释处理1.用力摇匀水样20～25次2.稀释：按1：10倍比稀释10mL90mL1mL水源水10-11009mL10-210-31mL9mL3.细菌总数及大肠菌群的检测步骤*1mL45℃营养琼脂20mL旋转混匀①②菌落总数每个水样做两皿平行对照，另取一皿做空白对照10010-110-210-337℃，24h③*大肠菌群1mL10010mL普通浓度乳糖蛋白胨培养液×51mL10-110mL普通浓度乳糖蛋白胨培养液×51mL10-310mL普通浓度乳糖蛋白胨培养液×51mL10-210mL普通浓度乳糖蛋白胨培养液×510mL1005mL3倍浓缩浓度乳糖蛋白胨培养液×5*培养24h后观察结果若大肠菌群的培养管产酸产气则按以下步骤进行伊红美蓝培养基取产酸产气的培养液37℃，24h挑取菌落革兰染色镜检，复发酵37