酶联免疫吸附实验.pdf

免疫酶技术是本世纪年代末期发展起来的一种免疫检测方法，是目前最广泛应用的

标记免疫技术。1966年Nakene和Pierce共同发表了《酶标抗体：制备和抗原定位中的应

用》，首先提出了免疫酶技术的基本原理。1971年Engvall和Perlmann发表《酶联免疫吸

附试验测定IgG含量》一文，使免疫酶技术成为一种实用的检测液体标本中微量物质的方

法。目前免疫酶技术已广泛用于免疫学、微生物学、寄生虫学等。由于其具有灵敏度高、试

剂稳定、设备简单、操作安全等优点，近几年也将其应用到食品领域中来检测某些食品中的

生理活性物质。

一、基本概念

1、免疫：笼统地概括起来，免疫就是人和动物机体防御、排除外来物质(异物)进人体内，

同时识别和清除体内死亡、变性物质和平定体内叛乱分子突变细胞，以保护和稳定自身的防

护机制。

2、抗原：抗原是指那些能够诱导机体的免疫系统发生免疫应答，产生抗体和致敏效应淋巴

细胞，并在体内外与之特异性结合，发生免疫反应的物质。

3、抗体：是能与相应的抗原专一性结合的蛋白质分子，和机体其他生物大分子一样是细胞

的产物，分泌到体液中或表现在细胞表面上。

4、抗原、抗体反应：抗原和抗体在体外的反应亦称血清学反应。这类反应可借助免疫学方

法进行检测。

二、抗体定量检测方法及其原理

定量分析抗体的常用方法有扩散法、酶联免疫吸附法和火箭免疫电泳法等。

1、免疫扩散法

1.1、单向免疫扩散法

原理：将待检抗原滴加于含相应抗体的琼脂板小孔中，经一定时间扩散后。形成乳白色

的沉淀坏，在一定浓度范围内，抗原的含量与沉淀坏直径成正比。可以先用己知不同浓度的

标准抗原制成标准曲线，再根据测试样品沉淀环直径的大小，从标准曲线上查出样品中抗原

的相应含量。

1.2双向免疫扩散法

原理：可溶性抗原与已知可溶性抗体分别加入相邻的琼脂糖凝胶板上的小孔内，在电解

质存在下让它们相互向对方扩散。当两者在最适当比例处相遇时，即形成一条清晰的沉淀线。

根据最大稀释度与已知标准品最大稀释度之比，可计算出抗体含量。

原理：抗原在电场力的作用下向前移动，当抗原在通过含有一定量单一抗体的琼脂凝胶

时，即形成抗原抗体复合物，比例合适即沉淀下来。因抗体迁移率低，而抗原随电泳向前移

动，因而使抗原、抗体形成圆锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，峰的高度与抗原的浓度呈

正比。

3、酶联免疫吸附法((ELISA)

原理：ELISA可用于测定抗体，也可用于检测杭原。其基本原理是采用抗原与抗体的

特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象

可以是抗体也可以是抗原。3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）；②酶

标记的抗原或抗体（标记物）；③酶作用的底物（显色剂）。

ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体,再加相应

酶标记抗体，生成抗原--待测抗体--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产

物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。

根据检测目的和操作步骤不同，有以下三种类型的常用方法：

3.1间接法此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体。加人待检标本(含

相应抗体)与之结合。洗涤后，加人酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。

3.2双抗体夹心法此法常用于测定抗原。将已知抗体吸附于固相载体，加人待检标本(含相

应抗原)与之结合。温育后洗涤，加人酶标板中。

3.3竞争法此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，

将特异性抗体吸附于固相载体。加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竟争与固相

抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。

三、酶联免疫吸附法测定抗体含量（竞争法）

1、仪器设备

酶联免疫检测仪(Bio－550)；酶标板(96孔)；微量注射器。

2、试剂

(1)HRP标记羊抗兔IgG(1:1000，国产)；标准牛IgG；兔抗牛血清（1:256）；

(2)包被液：0.05mol/LpH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存,Na2CO30.15g,NaHCO30.293g,

蒸馏水稀释至100mL。

(3)稀释液与洗涤液：0.01mol/LpH7.4PBS--Tween--20,