基因的分离与鉴定.ppt

菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据第63页,共83页，2024年2月25日，星期天菌落原位杂交法的基本操作：用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜80℃烘干固定影印薄膜薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜用X光胶片覆盖薄膜感光第64页,共83页，2024年2月25日，星期天利用免疫学的原理，检测克隆基因的表达产物。免疫化学检测法第65页,共83页，2024年2月25日，星期天该方法类似于原位杂交法优点：方法简便，一次可检测大量的克隆子缺点：克隆基因必须表达并具有相应的抗体1.放射性抗体检测法第66页,共83页，2024年2月25日，星期天1.免疫血清含有几种IgG抗体，识别抗原分子上不同定子，并分别同各自识别的抗原定子相结合；2.抗体分子或抗体的F（ab）部分，能够牢固的吸附在固体基质上（聚乙烯等塑料制品），而不容易被洗脱掉；3.通过体外碘化作用，IgG抗体会迅速的被放射性同位素125I标记上。原理：第67页,共83页，2024年2月25日，星期天1.菌落溶解释放出抗原蛋白质；a.把平板放置在氯仿蒸气中；b.用烈性噬菌体的气溶胶喷洒；c.用带有能被热诱发的原噬菌体的寄主菌处理。2.将连结在固体支持物上的抗体缓慢的同溶解的细胞接触，形成抗原－抗体复合物3.将固体支持物取出，与放射性标记的第二种抗体温育；4.放射自显影检测。步骤：第68页,共83页，2024年2月25日，星期天用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板用固定了特异性抗体的聚乙烯薄膜影印裂解平板轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定与II125标记的IgG保温洗涤、干燥、感光放射免疫原位杂交鉴定第69页,共83页，2024年2月25日，星期天细菌菌落溶解，释放出抗原蛋白质第70页,共83页，2024年2月25日，星期天双位点检测法：适用于含有杂种多肽菌落分析。杂种多肽A–B（A）抗体（B）抗体固定在固体基质125I标记第71页,共83页，2024年2月25日，星期天滤膜抗体溶液放射性标记抗体检测法的操作程序聚乙烯薄膜培养皿及菌落放射性标记抗体检测法的操作程序第72页,共83页，2024年2月25日，星期天在生长菌落的琼脂培养基中，加入专门抗这种蛋白质分子的特异性抗体。如果菌落的细菌会分泌出某种蛋白质，那么它的周围，就会出现一条由一种叫做沉淀素的抗体-抗原沉淀物所形成的白色的圆圈灵敏度低，易受干扰，实用性差。2.免疫沉淀检测法第73页,共83页，2024年2月25日，星期天免疫沉淀鉴定：第74页,共83页，2024年2月25日，星期天用专门设计的表达载体，将真核基因编码的蛋白质在大肠杆菌中实现表达，通过免疫化学法进行检测。3.表达载体产物之免疫化学检测法第75页,共83页，2024年2月25日，星期天第76页,共83页，2024年2月25日，星期天用来检测同DNA特异性结合的蛋白质因子的一种方法操作程序：1.用硝酸纤维素滤膜进行“噬菌斑转移”，使其中的蛋白质吸附在滤膜上；2.将滤膜同放射性标记的含有DNA结合蛋白质编码序列的双链DNA寡核苷酸探针杂交；3.根据放射自显影结果筛选出阳性反应克隆。蛋白质筛选法第77页,共83页，2024年2月25日，星期天DNA结合蛋白编码基因的鉴定：用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板用聚乙烯薄膜影印裂解平板轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定80℃烘干固定影印薄膜与探针溶液中杂交洗涤、干燥、感光探针选用能与目标蛋白特异性结合的DNA片段第78页,共83页，2024年2月25日，星期天1.杂交抑制的转译该方法用于cDNA文库中目的基因的筛选。其原理是在体外无细胞的转译中利用cDNA与mRNA杂交后导致mRNA的不能翻译，从而筛选阳性克隆子。分离的基因编码着丰富的mRNA。优点：不需要克隆基因的表达