第一节 克隆载体课件.ppt

第一节克隆载体第一节克隆载体

质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份.Plasmid一词由JoshuaLederberg于1952年提出。质粒的命名:例:pBR322一、质粒载体p代表质粒;“BR”代表两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首,“322”是实验编号.第一节克隆载体

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已在形形色色的细菌类群中发现，大多数质粒的宿主范围较窄，只能生存于亲缘关系很近的少数细菌种类中。是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位已进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝并将质粒分子精确地分配给子代细胞。1.质粒的特点：（一）质粒的基本性质第一节克隆载体

其复制和转录或多或少依赖于宿主编码的酶和蛋白质。常常含有一些编码对细菌宿主有利的基因。这些基因可赋予宿主迥然不同的特征，其中不少具有重要的医学和商业价值。由质粒产生的表型包括产生抗生素、大肠杆菌素、肠毒素、限制酶与修饰酶，以及降解复杂的有机化合物等。第一节克隆载体

质粒通过合成长效致死物和短效解毒剂得以在细菌中生存.第一节克隆载体

质粒绝大多数是环形双链的DNA但也存在有线形质粒、RNA质粒（酵母的杀伤质粒）2.质粒的生物学特征只能在在寄主细胞内独立增殖，随寄主分裂而遗传。自然界中，无论是真核生物还是原核生物细胞，甚至真菌的线粒体中都发现有质粒的存在。质粒DNA分子可以稳定存在于染色体外，呈游离状态,有一些质粒在一定条件下能可逆地整合到寄主染色体上，随染色体的复制而复制,称为附加体第一节克隆载体

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3.环形双链DNA质粒分子组成与构型多数为双链环状DNA分子.分子量从不足2kb到100kb以上,多数为10kb左右.具有三种不同的构型：共价闭合环形DNA(cccDNA):两条多核苷酸链均保持完整的环形结构。DNA呈超螺旋的SC构型。开环DNA(ocDNA)：有一条保持完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口。即OC构型。线性分子（lDNA)：经限制性内切酶切割之后，双链断裂而形成。称L构型。第一节克隆载体

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4.作为克隆载体质粒的条件适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必须包括三种共同的组分：复制子选择性标记基因克隆位点基因克隆载体还需要满足具有较小的分子量和较高的拷贝数第一节克隆载体

根据分子特性，革兰氏阴性细菌的质粒可分为两种接合型又叫自主转移的质粒具有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。

可以在不同细胞间转移。非接合型的质粒不能自我转移的质粒。失去控制细菌配对和质粒接合转移的基因。不能自主转移5、质粒的类型第一节克隆载体

F质粒的tra区包含细菌接合所需的基因第一节克隆载体

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质粒的转移与迁移.转移一般指一个质粒独立地从一个细胞转移到另一个细胞.迁移则指本身不能转移,在另一个接合型质粒存在下,从一个细胞移至另一种细胞.质粒迁移的条件:①bom位点(colE1)nic位点.②mob基因.结合动员基因.编码迁移蛋白,实质是一种核酸酶,切割nic位点.迁移作用(mobiligation):由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程.第一节克隆载体

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从基因工程安全角度考虑，接合型质粒不宜作为克隆载体。因为从理论上存在着发生使ＤＮＡ跨越生物种间遗传屏障的潜在危险.而利用迁移作用可能将非接合型质粒从一种细胞转移至另一种细胞,这种方法叫三亲杂交法.一般将受体菌、供体菌及辅助转移菌三者共培养过夜.在基因工程中得到大量的应用.第一节克隆载体

三亲杂交法第一节克隆载体

根据质粒的性状特征，可分为五种不同的类型：F(Fertility)质粒:Ｒ(Resistance)质粒Col质粒降解质粒（Degradativeplasmids）致瘤质粒（Virulenceplasmids）农杆菌Ti质粒

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根据质粒的表现分为:定义：质粒除了与控制本身复制和转移相关的基因外，有的质粒还携带一些其他的基因，宿主细胞由于含有这样的质粒而呈现出新的性状，这样的质粒称为显性质粒。相反，即使宿主细胞含有某种质粒，但无异样性状表露，这样的质粒称为隐蔽质粒。受检测手段的限制，现定为隐蔽型的质粒未必是真正的隐蔽质粒。显性质粒和隐蔽质粒第一节克隆载体

人工构建的质粒根据其功能及用途分为:(1)多拷贝质粒(2)测序质粒(3)整合质粒

(4)穿梭质粒(5)表达质粒(6)探针质粒第一节克隆载体

环状质粒的复制形式主要分theta(θ)