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标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量(同名4028)

标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量

标准曲线

一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。

蛋白质含量测定方法

凯氏定氮法

双缩脲法

Folin-酚试剂法

紫外吸收法

考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作

（一）、试剂：

考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝G—250100mg溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%H3PO4，加蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。

标准蛋白质溶液：

纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。

（二）、器材：

1、722S型分光光度计使用及原理

2、移液管使用

（三）、标准曲线制作：

试管编号

0

1

2

3

4

5

6

100ug/ml标准蛋白（ml）

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.15mol/LNaCl（ml）

1

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

考马斯亮蓝试剂（ml）

5

5

5

5

5

5

5

摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色

A595nm

1、

2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20ug、30ug、40ug、50ug、60ug），在坐标轴上绘制标准曲线。

1）、利用标准曲线查出回归方程。

2）、用公式计算回归方程。

3）、或用origin作图，测出回归线性方程。即A595nm=a×X()+6

一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。

4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。

（四）、蛋白质含量的测定：

样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。

（五）、注意事项：

玻璃仪器要洗涤干净。

取量要准确。

玻璃仪器要干燥，避免温度变化。

对照：用被测物质以外的物质作空白对照。

药品的配制（磷酸缓冲液的配制）

一、药品的配制步骤

（一）、实验准备：

准备所需的药品和玻璃仪器。

洗涤。（怎样洗涤算干净？）

（二）、计算：

1、百分比浓度计算：

1)、G/V比

例如配1%NaCl，称1gNaCl溶于100ml水。

2）、V/V比：

例如配75%乙醇100ml，75%×100%=100%×X,X=75ml。取75ml无水乙醇，加25ml蒸馏水。

乙醇：乙醚：丙酮=2：1：2配500ml，各取200ml，100ml，200ml混合。

3）G/V比：用的较少，如计算灰分中某种元素如Fe的含量。

2、摩尔浓度计算：注：药品的分子量一般在标签中注明。

1）、0.1M或0.1mol/LNaCl配100ml。

M=质量/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g摩尔数=G（g）/摩尔质量

2）、0.1mMNaCl配100ml

mM=毫摩尔数/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g

毫摩尔数=G（mg）/摩尔质量

3）、0.1uNaCl配100ml

mM=微摩尔数/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4mg

微摩尔数=G（ug）/摩尔质量称取NaCl0.1×0.1×40=0.4ug

混合溶液配制的计算：

如配3uMEDTA，2.25mMNBT以及60uM溶液100ml，用50mM磷酸缓冲液配制。

注意：1、分别标定体积计算

2、分别配制再混合，但总体积不能为100ml

磷酸缓冲液（phosphatebuffer）

1mol/L磷酸二氢钠（ml）

1mol/L磷酸氢二钠（ml）

最终pH值

920

80

5.8

900

100

5.9

877

123

6.0

850

150

6.1

815

185

6.2

775

225

6.3

735

265

6.4

685

315

6.5

625

375

6.6

565

435

6.7

510

490

6.8

450

550

6.9

390

610

7.0

330

670

7.1

280

720

7.2

230

870

7.3

190

810

7.4

160

840

7.5

130

870

7.6

105

895

7.7

8