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免疫沉淀和免疫印迹

免疫沉淀和免疫印迹（WesternBlotting）

在细胞生物学研究中，有时要对细胞膜分子、胞内分子或表达产

物进行定性或／和定量。但由于靶蛋白表达水乎不太高，用细胞裂解

液或表达上清进行SDS电泳、免疫印迹（Westernblot）检测

很难达到实验目的。为此可用特异性识别靶蛋白的抗体进行免疫沉淀，

纯化和富集靶抗原。免疫沉淀所获得的蛋白可进行SDS－PAGE电泳，

经考马氏亮蓝染色或银染后观察目的蛋白条带。如果免疫沉淀得到的

目的蛋白量低于考马氏亮蓝染色或银染的检测下限，可采用Western

blot检测方法，提高检测的灵敏度，达到实验目的。

免疫沉淀

（一）原理

免疫沉淀是利用抗原抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方

法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A

／G（ProteinA／G）或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育，

通过离心得到珠子－蛋白A／G或二抗－抗体－目的蛋白复合物，沉淀

经洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5－10min，在高温及还原

剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目

的蛋白和少量的杂蛋白。

（二）试剂

1．PBS：8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24g

KHPO溶于800ml双蒸水中，用HCl调PH至7.4，在补加水至1L，

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高压灭菌后保存于室温。

2．NaCl：5.8gNaCl溶于80ml双蒸水中，再补加水至100ml，

高压灭菌。

3.11MTris（pH7.5）:12.1gTris碱，溶于80ml双蒸水，用

HCl调pH至7.5，再补加水至100ml。

4．蛋白酶抑制剂：Aprotinin和Leupeptin溶于双蒸水，PMSF

溶于异丙醇，浓度均为10mg/ml。

5．N-40：10％（w／V）。

6．脱氧胆酸钠：10％（w／v），溶于10mMHEPES（pH

8.0）。

7．细胞裂解液：50mMTris（pH7.5）、150mMNaCl、0.1

mg/mlPMSF、1ug/mlAprotinin、1ug/mlLeupeptin、l％NP-40、

0.5％脱氧胆酸钠。

8．稀释液：50mMTris（PH7.5）、150mMNaCl、0.1mg／

mlPMSF、1ug／mlAprotinin，1ug/mlLeupeptin、0.1％NP-40。

9．洗涤液Ⅰ：50mMTris（pH7.5）、150mMNaCl、0.1％

NP-40。

10．洗涤液Ⅱ：10mMTris（pH7.5）。

11．ProteinA／G－Agarose。

12．2×SDS－PAGE电泳上样缓冲液：100mMTris（pH6.8）、

200mMDTT、4％SDS、0.2％溴酚蓝、20％甘油。

（三）操作步骤

1．离心收集细胞，PBS洗涤2次。细胞用量根据目的蛋白表达的

水平而定，一般用1×107－5×107细胞。

2．按1×107细/ml加人细胞裂解液，于冰浴上超声破碎，然后

再冰浴30min。

3．4℃12000×g离心10mn，取上清。