[精品]实验三 骨髓法制备小白鼠 染色体标本.pptVIP

实验三?骨髓法制备小白鼠染色体标本第二局部细胞遗传学一、实验目的在骨髓细胞中，有丝分裂的指数是相当高的，通过注射秋水仙素使正在分裂的细胞停止在有丝分裂中期，再经过低渗、固定、滴片就可以获得大量的骨髓细胞染色体分裂相。二、实验原理1、研究染色体的材料处于分裂旺盛期的组织：〔1〕动物的骨髓、外周血淋巴细胞、睾丸等。〔2〕果蝇三龄幼虫的唾腺〔3〕植物的根尖〔如洋葱〕2、研究染色体的方法1、材料获取直接获取细胞〔骨髓、唾腺〕细胞培养〔猪淋巴细胞培养法〕2、非切片法滴片法－－细胞培养材料、骨髓压片法－－果蝇唾腺，植物的根尖{{三、实验材料、仪器和试剂材料：小白鼠〔22～25g〕。仪器：显微镜、注射器、10ml离心管、吸管、试管架、载玻片、恒温水浴锅、离心机、剪刀、磁盘、镊子等。试剂：秋水仙素、KCl、磷酸缓冲液、冰醋酸、甲醇、Giemsa液等。1、秋水仙素处理：取骨髓前2～3h，给小白鼠腹腔注射秋水仙素液〔注射剂量为2μg/g小白鼠体重〕四、制备步骤2、杀鼠取髓：采用脱颈椎法处死小白鼠。用剪刀剪开后腿上的皮肤和肌肉，取出股骨，剔净皮肉，再用剪刀剪掉股骨两端，用注射器分两次吸取0.075MKCl溶液〔共5ml〕通过针头注入骨髓腔缓慢将细胞冲入离心管，反复冲洗直到骨髓腔发白为止。本卷须知：注射器剪掉剪掉3、低渗：将获得的骨髓悬液用吸管立即将细胞团吹散打匀，两组同时放入37℃恒温水浴锅内低渗30min。低渗结束时，向试管中参加加预固定液〔甲醇：冰乙酸＝3:1，现配现用〕8～10滴，混合均匀〔以防细胞结团〕，平衡〔注意2管同时离心〕后1000r/min离心10min，弃上清。4、第一次固定：在弃去上清液的试管中。参加新配的3:1甲醇冰醋酸固定液5~6ml，用吸管轻轻吸打均匀，室温静置30min进行第一次固定。平衡后1000r/min离心10min，弃上清〔可留0.5ml〕。5．第二次固定：在弃去上清液的试管中。参加新配的3:1甲醇-冰醋酸固定液5~6ml，用吸管轻轻吸打均匀，室温静置30min进行第二次固定。平衡后1000r/min离心10min，弃上清〔留0.2ml左右〕。6、滴片：在弃去上清液的试管中参加适量〔2～10滴，在老师辅导下加〕新配固定液，用吸管吹打均匀制成细胞悬液，滴2～3滴于冰冻的载玻片上，立即用嘴吹气使细胞迅速分散，在载玻片后面一角写上学号，空气枯燥。7、染色：将染色体制片细胞面朝下反扣于染色板上，用1：9Giemsa稀释液染色30min，小水流自来水冲洗浮色，空气枯燥后，显微镜下观察。小白鼠睾丸细胞分裂10倍物镜下小白鼠的染色体分裂相〔2n＝40〕五、骨髓法需要注意的问题1、秋水仙素的量一定要适宜，太少分裂相少，太多染色体短粗。2、为了节省时间，可直接用低渗液〔约5ml〕冲骨髓入离心管。3、注意将两组离心管同时放入水浴锅中，由1人记录时间，同时进行预固定，然后离心。4、低渗时间一定要严格时间,加预固定液8滴，混合均匀平衡离心〔注意2人一组同时离心〕