PCR基本原理及荧光PCR.ppt

实时荧光定量PCR原理----扩增曲线扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件实时荧光定量PCR原理-----荧光阈值荧光信号阈值〔threshold〕：前15个循环信号作为荧光本底信号〔baseline〕，即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准差的10倍手动设置：原那么要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99真正的信号:荧光信号超过域值实时荧光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号到达设定的阈值时所经过的扩增循环次数。C(t)value实时荧光定量PCR原理---Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值那么极具重现性实时荧光定量PCR原理---------定量原理理想的PCR反响：X=X0*2n非理想的PCR反响：X=X0(1+Ex)nn：扩增反响的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率实时荧光定量PCR原理---------定量原理在扩增产物到达阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号到达阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:lgM=lgX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:lgX0=-Ct×lg(1+Ex)+lgM(3)Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增到达域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。实时荧光定量PCR原理---------标准曲线模板DNA量越多，荧光到达域值的循环数越少，即Ct值越小。Log浓度与循环数呈线性关系，通过起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。实时荧光定量PCR原理---------定量原理理想的PCR反响：X=X0*2n非理想的PCR反响：X=X0(1+Ex)nn：扩增反响的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率原因？Taq酶、引物、模版等PCR要素消耗PCR扩增效率越来越低产物增长速度逐渐减慢最终到达平台期荧光定量PCR中荧光产生的机制非探针类探针类染料染色SYBR?GreenI溴乙锭(EthidiumBromide)探针标记TaqManTMTaqManMGBDual-oligoFRETpairs分子信标(Molecularbeacons)ScorpionsTM/AmplifluorTM探针法小结NoBlots!NoGels!既灵敏又特异：PCR与分子杂交的结合双倍放大：PCR放大与荧光放大的结合PCR的根本原理及荧光PCR聚合酶链反响〔polymerasechainreaction,PCR〕,又称无细胞克隆技术。PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反响的创造ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反响的创造ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反响的创造AT