抗体的生物制备.ppt

基因工程制备抗体姓名：张胜男专业：08级药物制剂学号：2008123044基因工程制备基因工程抗体基因工程抗体(Geneticengineeringantibody)根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。基因工程抗体常规技术抗体基因可用适当的探针从抗体细胞基因组文库中获得，也可以从分泌抗体的细胞中分离mRNA，用RT-PCR方法获得。用已知基因的片段或寡核苷酸片段作为探针，从分泌特异性抗体的杂交瘤细胞基因文库中分离DNA（含VDJ重排基因），筛选出V区基因。通过DNA印迹（Southernblotting）区分重排和未发生重排的克隆，所获得的基因含有转录调控元件及mRNA加工信号，易于在真核表达系统中表达。最常用的是PCR扩增方法。从杂交瘤细胞中分离mRNA，反转录为cDNA库。在抗体基因中保守的第一骨架区序列/前导序列和J基因区段/C区序列设计引物进行PCR扩增。

基因工程抗体三大环节●分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立●构建McAb的基因文库及其表达载体●转化到动物非淋巴细胞中进行表达。（二）构建基因文库及载体获得目的基因寻找合适载体并形成重组DNA1、提取目的基因C区基因的序列比较恒定，可以很容易地获得，关键是准确地获得编码抗体可变区(特别是抗原结合位点区)的基因。目前可能从分泌特异性抗体的杂交瘤株的cDNA文库和基因组文库中进行筛选。直接从小鼠杂交瘤细胞中获得抗体基因在液氨中破碎小鼠杂交瘤细胞用EDTA充分抑制DAase活性，用去污剂和蛋白酶K共同裂解细胞，将DNA和蛋白质分离数次用苯酚提取获得高纯度的基因组DNA正常情况下V区基因不表达，只有经过重排使VJ相连接后的基因才可以表达出具有抗原结合能力的Fv段。因此，勿需事先弄清V区的氨基酸排列顺序，只需使用J链基因(该基因的核苷酸序列变异小，可用于共用探针)探针即可从构建的cDNA文库中筛选出含V区基因外显子的基因克隆。杂交瘤细胞系经常会有一些异常重排的V区基因，其中的部分还可以具有转录活性。因此为获得正确的目的基因，还有必要进一步的鉴定。通过PCR技术合成较多的V区基因，较容易获得目的基因。Ig的V基因和C基因均由不同的外显子构成，抗体的每个功能区蛋白均由独自的外显子编码，这给体外加工和重组抗体基因组V和C区的基因带来了便利氨基酸反推法逆转录法⒈mRNA的纯化⒉cDNA第一链的合成⒊cDNA第二链的合成⒋利用PCRJISHU对cDNA克隆质粒所具有的特点具备完整的真核转录单位，可以整合到宿主细胞染色体中，并表达或能自行复制其DNA因为只有约103～106的真核细胞被转染，因此要从中筛选出被转染的阳性表达细胞，所以该质粒应具备选择性基因标记，其基因产物可在选择性培养基中进行鉴别其DNA片段容易被修饰，可进行适宜的插入或剪接内含适宜的限制酶的酶切位点，使适宜的DNA片段容易克隆。（三）导入细菌或动物非淋巴细胞真核细胞：1、病毒感染法2、电穿孔法3、显微注射法4、磷酸钙共沉淀法原核细胞：1、氯化钙法2、电穿孔法3、病毒感染法为生产出具有功能活性的新型抗体分子，需将编码轻、重链的H和L基因同时导入受体细胞，并使之等量(或接近等量)地表达和装配。目前采用了两种方法：①分别构建表达H基因和L基因的载体，并用两个载体同时转染受体细胞，该法便于遗传学操作，但只有两种载体同时转染成功并产生等量轻、重链时，才能有效地装配成功能性抗体，因此两种载体应载有不同的抗性基因(多采用neo基因-转染的细胞表现为G418抗性和gpt基因转染的细胞表现为霉酚酸mycophenolicacid抗性)，并同时使用两种制剂做双重抗性筛选；②将轻、重链基因插入同一载体，该法利于筛选，但插入的基因序列过长，给基因操作带来一定的困难。基因工程抗体的表达(一)在哺乳动物细胞（CHO）中的表达(二)在微生物(原核)细胞中的表达(三)在植物中表达（四）在酵母中表达谢谢****流程（一）分泌单抗的杂交瘤细胞的建立★此法制的基因只能导入到真核细胞中表达抗体某区的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列抗体基因推测化学合成推测氨基酸反推法逆转录法2、选择载体并将目的基因和载体结合载体质粒外源DNA片段外源DNA插入剪切