植物基因组DNA的提取 .pptVIP

(1)调体积选取至所需值；(2)套上枪头；(3)垂直持握枪式移液器外壳，按下拇指至第一档；(4)将枪头插入溶液，徐徐松开大拇指，使其复原。(5)排放时，重新将大拇指按下，至第一档后，继续按至第二档排空。注：移液过程应控制速度、力度。移液器的使用一、实验目的：1.了解真核生物基因组DNA提取的一般原理。2.掌握DNA提取的方法和步骤。基因组DNA提取的原理和方法DNA与组蛋白构成核小体，核小体缠绕成中空的螺旋管状结构，既染色质丝，染色质丝在与许多非组蛋白形成染色体。染色体存在于细胞核中，外由核膜和细胞膜包被。从组织中提取DNA必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎细胞膜和核膜，使染色体释放出来，同时去除与DNA结合的组蛋白及非组蛋白。样品预处理植物材料——液氮研磨动物材料——匀浆、液氮研磨细菌材料——溶菌酶破壁酵母材料——破壁酶破壁、玻璃珠研磨食用油——正己烷乳化细胞裂解CTAB法适用于植物材料组织、真菌等CTAB十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（0.7MNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。SDS法适用于血液、细胞、动植物组织、细菌、酵母等SDS十二烷基磺酸钠是一种阴离子去污剂，高温（55-65℃）下可裂解细胞，使蛋白变性、染色体离析。分离纯化核酸总的原则：①应保证核酸一级结构的完整性（完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求）；②排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染。③无其他核酸分子的污染（如抽提DNA分子时应去除RNA分子）。分离纯化纯化要求核酸样品中不应存在对酶（内切酶、DNA聚合酶）有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他生物大分子如蛋白、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度排除其他核酸分子的污染，提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然纯化方法硅质吸附原理：主要利用DNA与硅基质材料在高盐中结合，低盐条件下分离的特征，其机理可能为高浓度盐离子破坏硅质水分子结构，形成阳离子桥，当盐被清除后，再水化的硅石破坏了基质和DNA之间的吸引力，因此DNA从硅基质上洗脱下来分离核酸应注意以下几点：①减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对DNA双链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH值4.0-10.0的条件下进行②减少物理因素对核酸的降解：避免剧烈震荡、搅拌、DNA样品的反复冻溶和高温③防止核酸的生物降解：进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中，使用金属离子螯合剂(EDTA乙二胺四乙酸）能螯合金属离子，抑制DNA酶的活性。DNA洗脱收集采用硅基质膜吸附分离DNA后，可将DNA在低盐高pH条件下洗脱下来，pH值在7.0-8.5之间有最大洗脱效率。洗脱缓冲液多用TE(10mMTris-HCl;1mMEDTA;pH值在8.0),加洗脱液TE之前,先在水浴中预热10分钟，可有效提高DNA洗脱效率DNA的贮存DNA为两性分子，在碱性条件下稳定，一般用保存。ddH2O的正常值为pH7.0，可以作为的贮存溶液基因组DNA分子质量太大，制成干品后很难溶解，而搅拌又容易引起DNA分子断裂，一般不需制成干品三、材料

植物组织（转基因烟草）四、设备

移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，1.5ml离心管。

操作步骤：1处理材料：取植物新鲜组织100mg或干重组织20mg，加入液氮充分碾磨。加入700μl65℃预热缓冲液CTAB，剧烈震荡2-5秒钟，65℃放置10-20分钟。2加入700μl氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5分钟。3小心吸取上清500μl并移到一个新的EP管，注意不要吸到界面物质。4向上清液中加入2倍体积冰冷的无水乙醇，轻轻颠倒几次充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。5用枪头将絮状沉淀挑入一个新的离心管中，加入1ML70%乙醇轻轻颠倒几次充分混匀，12,000rpm离心30秒，倒掉废液；12,000rpm离心30秒用移液器吸干残留的乙醇，沉淀晾干让残留的乙醇挥发干净。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。6上清液中加入2倍体积冰冷的无水乙醇后如没有絮状沉淀出现，EP管放-20℃沉淀5-10分钟，12,000rpm离心5分钟，倒掉废液；加入1ML70%乙醇轻轻颠倒几次充分混匀，1