植物胚胎(胚乳)培养及离体授粉 PPT.pptxVIP

6

⚫

影响花药/小孢子培养的关键因素基因型、小孢子发育时期

不同Brassicanapus基因型的小孢子产胚率

Genotype

Embryoid/10microspore

Seedling(%)

Topas

10000-200000

1-20

Westar

1000-10000

0.1-1

Delta

100-10000

0.01-1

Bounty

10-100

0.001-0.01

⚫供体植株的生理状态和环境条件(Physiologicalstatusofdonorplant)

光周期、光照强度、温度等对以后的花粉离体培养有很大影响。一般田间比温室，幼龄比老龄植株易于培养。主茎易于侧(次)分枝

⚫培养基及培养条件

单倍体植株的加倍方法⚫自然加倍

⚫人工加倍：化学药剂处理(有丝分裂抑制剂）

原生质体定义

指采用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞

原生质体纯化方法

Sedimentation(沉降法)

Flotation(上浮法，用23%蔗糖)

界面法

6

原生质体培养

原生质体计数:原生质体培养前必须调到一定密度,即确定每毫升培养基中含多少原生质体.用CPW13M悬浮原生质体,血球计数板计数,计算稀释倍数

浓度：一般~10

原生质体培养方法

⚫液体浅层培养(Liquidthinlayerculture):将纯化后的原生质体悬浮于液体培养基中,再取少许于培养皿底部形成很薄的一层，封口培养。

⚫固体培养(Solidculture):叫琼脂糖平板法(Agaroseplateculture)或包埋培养法(Embeddingculture)。将原生质体悬浮于液体培养基后，与凝固剂(主要是琼脂或低熔点琼脂糖，LMTagarose)按一定比例混合，在培养皿底部形成一薄层，凝固后封口培养

⚫固液双层培养法(Solidoverliquidculture):此法结合液体浅层培养和固体培养的优点，在培养皿底部先铺一层固体培养基，待凝固后再在其上进行液体浅层培养。固体培养基中的营养成分可以被液体层中的原生质体吸收利用，而原生质体产生的有毒物质可以被固体培养基吸收。

◼原生质体培养好坏的标准之一：植板率(Platingefficiency)，即形成愈伤组织的原生质体数量占所培养原生质体总数的百分比

原生质体再生

⚫细胞壁再生:原生质体培养后经过一段时间会再生出细胞壁，原生质体在培养初期仍然为圆球形，随着培养时间的延长，逐渐变为椭圆形，此时表明已经开始再生细胞壁。不同原生质体再生细胞壁时间：从几小时到几天。

➢细胞壁检测方法：荧光增白剂（CalcofouorWhite，CFW),一种二苯乙烯类化合物，非特异性荧光染料，能非特异性结合糖苷键连接多糖，如几丁质、葡聚糖和纤维等，荧光显微镜下发出荧光。

0h

3h

6h12h

18h24h

36h36h

Cottonprotoplasts

B、D、F、H、J、L、N、PCFW染色

⚫原生质体增殖：第一次分裂通常发生在培养后2-5天

⚫植株再生:具有再生能力的原生质体就会不断分裂，形成多细胞团。当细胞团进一步发育成为肉眼可见的小愈伤组织(Minicallus)，及时转移到分化培养基(Differentiationmedium)中培养

原生质体融合

原生质体融合(Protoplastfusion):

即细胞融合(Cellfusion)，也叫体细胞杂交(Somatic

hybridization)，超性杂交(Parasexualhybridization)或超性融合(Parasexualfusion)。是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程。为了与有性杂交区别开来，原生质体融合常常写作“a（+）b”，其中a和b是两个融合亲本，（+）表示体细胞杂交。

原生质体融合的意义

⚫克服有性杂交不亲和及生殖障碍

原生质体融合不涉及到雌雄性配子，从而可以克服远缘杂交的生殖障碍。

上世纪八十年代，有学者试图将番茄和马铃薯的原生质体融合，以图获得地上长番茄地下结马铃薯的植株(即番茄薯或薯番茄)。GeorgMelchers教授等通过原生质体融合获得此类植株，虽然这种植株没有太大的经济价值，但其设想具有深远的意义

Pomato

⚫转移有利的农艺性状，创造新的种质材料

作物栽培品种常常缺乏某些抗性性状，在栽培中处于不利地位。野生种中具有很多优良的抗性，通过原生质体融合可以将野生种的抗性转移进栽培种中。

⚫转移胞质基因，为研究体细胞遗传提供途径和材料

现有研究表明，植物的细胞质控制着很多优良的性状，如线粒体控制胞质雄性不育，叶绿体控制的抗除草剂特性。由于