细菌的简单染色和革兰氏染色.ppt

微生物学实验中南民族大学工商学院环境与生物工程实验教学中心实验四

细菌的简单染色和革兰氏染色一、实验目的1.了解细菌的涂片及染色在微生物学实验中的重要性。2.学会细菌染色的基本操作技术，从而掌握微生物的一般染色法和革兰氏染色法。二、实验内容（一）细菌的简单染色实验原理(continued)实验材料1、菌种实验步骤涂片操作步骤（continued）1、涂片取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环沾取）生理盐水（或无菌水）于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从枯草杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混合并涂成薄膜。如用菌悬液或液体培养物，可用接种环挑取1-2环直接涂于载玻片上。注意（Notes）:1）载玻片要洁净无油迹2）滴生理盐水和取菌不宜过多3）涂片要涂抹均匀，不宜过厚。2、干燥室温自然干燥固定的目的：1）使细胞质凝固，以固定细胞形态；2）并使菌体牢固地附着在载玻片上。4、染色倒去染液，用洗瓶（内装自来水）轻轻冲洗，直至涂片上流下来的水无色为止；染色废液收集在废液缸中。Note:水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。6、干燥7、镜检（二）革兰氏染色G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质，故用乙醇等有机溶剂脱色时溶解了类脂质，增加了细胞的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，经番红复染呈红色。G＋细胞壁结构致密，用乙醇脱色处理后，肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍保留初染时的紫色。实验材料、试剂、器皿实验材料：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌试剂：草酸铵结晶紫、革兰氏碘液、95%乙醇、番红染液器皿：显微镜、接种环、载玻片、酒精灯实验步骤1.涂片2.初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。3.媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。4.脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约20－30秒，后立即用流水冲洗。5.复染：滴加番红染色液，染3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。6.镜检：观察染色结果并绘图。7.显微镜用毕处理。注意事项载玻片要洁净无油迹，滴生理盐水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不宜过厚。热固定温度不宜过高，否则会改变甚至破坏细胞形态。水洗时不要直接冲洗涂面，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是关键环节，脱色不足，阴性菌误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌误染成阴性菌。脱色时间一般约20～30s实验报告1.结果列表简述三株细菌观察结果，说明各菌株的形状、颜色和革兰氏反应并绘图2、思考题1）制备细菌染色标本时应注意哪些环节？2）如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间过长，又会怎样？3）为什么要等制片完全干燥后才能用油镜观察？4）涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样？要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？哪一步是关键？Why?**?一、实验目的?二、实验内容?三、实验材料?四、实验步骤?五、实验结果?六、思考题?简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。?常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。实验原理(continued)细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。?常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。?当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。枯草芽孢杆菌、大肠杆菌2、染色剂吕氏碱性美蓝染液齐氏石碳酸复红染液干燥固定染色无菌操作水洗干燥镜检操作步骤（continued）操作步骤（continued）3、固定固定方法：热固定：涂面朝上，通过火焰数次注意：温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态操作步骤（cont