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DNA

DNA提取及PCR扩增实验报告

PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳

刘琳1131428环境科学

一、实验目的

学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。

对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。二、实验原理

PCR扩增

多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐热Taq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温（72℃），在Tap酶作用下，用四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按指数方式扩增。经过30～40个循环，DNA扩增即可完成。

DNA琼脂糖凝胶电泳实验

DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。

三、实验材料

仪器：PCR扩增仪、0.2ul薄壁管、1.5ml离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。

试剂：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全长DNA样本、无菌ddH2O、模板DNA、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。

四、实验步骤

PCR扩增

本次试验选择细菌16SrDNAV3区片段进行扩增。

根据计算，首先取1.5ml离心管按照2.5ul10×Buffer、1ul dNTP、0.5ul341GC、

0.5ul534、0.125ulTaq、19.375uddH2O的比例配置足量的PCR反应体系。

分别向9个薄壁管中分别加入24ul的反应体系，并分别添加8种不同的模版，并于第

9个薄壁管中加入无菌ddH2O作为阴性对照。

将薄壁管放入PCR扩增仪中，按照预定程序进行PCR扩增。其中循环过程需要达到

30~40次。程序如下：

预变性： 94℃ 3min

循环： 94℃ 变性30s

55℃ 退火30s

72℃ 延伸30s

末次延伸：72℃ 5min

PCR扩增完成后，将样品取出并保存于15℃环境中。

DNA琼脂糖凝胶电泳实验

称取0.2g琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入适量的0.5×TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。摇匀，待冷却至60℃左右，在胶液内加入适量的EB。

取有机玻璃制胶板槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。

待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。

在槽内加入0.5×TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。取1μl缓冲液和5μl待测DNA

样品混合后，用移液枪滴加至凝胶的加样孔中。

接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过5V/cm，开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。

观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止电泳。

在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯，通过观察孔进行观察。

五、实验结果与讨论

如图所示：从左至右，分别是模版1-8号，第9列为阴性对照。前8列均有明显的条带出现，而阴性对照无显示，说明扩增整体效果很

如图所示：从左至右，分别是模版

1-8号，第9列为阴性对照。

前8列均有明显的条带出现，而阴性对照无显示，说明扩增整体效果很好。图中有上下两条线，上面一条线所覆盖的条带基本可以代表扩增的产生的片段位置，参照图可以看出扩增片段在200bp左右。在第9个阴性对照的第二条线处可以看到较为模糊的条带，并非是出现假阴性，而是由于二聚物而产生的条带。通过该条带与最右侧的marker对比可知该片段出现在100bp左右，并非由于实验操作等问题而产生的污染。

实验的照片显示实验结果有拖尾