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毕赤酵母表达学问归纳1
配制500×BIOTINstocksolution〔0.02%〕有这么3种方案:
1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中,放过夜,根本就能溶;
2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH,就很简洁溶解了;
3、水浴加热,温度不能高于50度。D-生物素是具有生物活性的生物素,也就是vitaminH。
在毕赤酵母代谢过程中,作为多种酶的辅基起作用。自然培育基中一般可以不单独添加,因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有肯定量的生物素,但是做高密度发酵还是必需要添加的。
有几个比较迷惑的问题请教大家:(很典型的小问题〕1、制感受态细胞,OD多少比较好?
pyrimidine战友的方法:取1mlGS115过夜培育物(OD约6-10)分装到1.5mlEP管中。说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高,再高了效率会很低
2、关于高效转化法,文献说用(LiAc),而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用,要用LiCl。
LithiumacetatedoesnotworkwithPichiapastoris.Useonlylithiumchloride.3、YNB到底能高温灭么?有的说能有的说不能。
过滤灭菌的怎么操作?
我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上,报纸包上,瓶盖放烧杯里单灭。然后把配好的溶液用注射器一点点推动去。
4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深,单灭则不会。该115度还是121度灭?网上搜了下,都有人用!
5、电转化参数用400欧还是200欧?有的用400,有的还特地说不是用400。都是从园里看到的!
电击参数:1.5KV,25uF,200欧姆〔不是400〕
6、电转后,在MD平板上长的应当就是整合了目的基因的重组子了吧?假设不想筛高拷贝的,是否PCR验证一下即可?
网友的答复:
ynb最好不灭菌,我是0.22um过滤处理的。invitrogen手册上可以灭菌的。
glucose和含氮化合物在一起简洁产生美拉德反响,这是配制培育基中的禁忌。颜色很深的话,根本不能使用了。
想请教下关于菌种保存的方法。
我现在是承受斜面保存的方法,但感觉每次接菌都要翻开斜面,而且每次的接菌量难免会有
不少的误差,所以很想问一下大家都是怎么保存菌种的,特别是甘油菌的保存方法。
我一般吸取300ul的菌液到灭菌的EP管然后加等体积的甘油,混匀.防于-20度.保存长的话最好放-80度冰箱一般OD是2-6,过夜菌
在筛选高表达菌种中,我一般有一下步骤,很很多人做的不太一样,和说明书也有点差异,如下:
每次转化前,均用多种酶切,BlgII/salI/sacI同时切,然后转化时,用GS115/KM71/KM71H同时转化,转化的条件也和大家一样,即1.5/25/200但是我用的是0.1的杯子,不是0.2的,转化后涂MM及YPD+0.25G,长出菌落后,即进展大规模的表达试验,这里我要重点说明的是,我直接用YPD表达的,一般48h后即进展大量的SDS-鉴定,鉴定时,样品不用浓缩,直接上样,看到目的带后再做PCR,测序。
我已用这儿方法做了好几个基因出来。关于酵母表达时BMMY的PH值
我也觉得PH7.0-7.5要比PH6.0好,我表达的两个蛋白都是这样,表达量要高一些。但也不能一概而论,不同目标蛋白表达最适pH不一样,不过表达的pH值最好要远离目标蛋白的pI。
像目前国内外做的最好的rHSA,最适pH或许5-6左右,也有不同的报道,可能和工艺页有关系。而我自己正在做的一个蛋白pH4较好,3、5表达时上清电泳目标带大量削减,杂带大量增多。
求助一下很麻烦的问题,大家在酵母表达过程中掌握目标蛋白降解方面有什么高招,小弟最近为这个有点儿焦头烂额。
我试过用酸消解酪蛋白,可是作用并不是很明显。
不知道兄台是胞内表达还是胞外表达,假设是分泌表达,目标蛋白确实简洁被降解。你可以尝试以下几种方法:1、尽可能降低培育液的pH值削减酶活,酵母生长pH值比较广,4~7都可以试一下;2、多试几种蛋白添加剂,充当酶解底物;3、摸索最适下罐〔摇瓶也一样〕,宁可少表达点也别给降解光了。实在没方法,只好换菌株或做pcr突变酶切位点〔固然不能影响表达和蛋白活性〕。
Severalstrategieshavebeenreportedaseffectiveinminimizingtheproteolyticinstabilityofspecificforeignprote
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