细胞融合与单克隆抗体.pptx

细胞融合与

单克隆抗体;2;细胞融合(cellfusion)：又称体细胞杂交(somatichybridization)或细胞杂交(cellhybridization)，是指在外力（诱导剂或促融合剂）作用下，两个或两个以上的细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成同种多倍体或杂种细胞的现象。;细胞融合示意图;?受精过程中的精卵融合、骨骼肌分化过程中多核肌细胞的形成等都是体内正常发育过程中的细胞融合现象。

?体外培养系统中，Lambert等发现体外培养的肿瘤细胞会自发进行融合，融合率在10-2~10-6之间；1962年日本的Okada发现紫外线灭活的仙台病毒可诱发腹水瘤细胞相互融合产生杂交细胞。;一、细胞融合的基本技术;7;8;促细胞融合的方法有：;1.病毒融合剂诱发细胞融合;?使用仙台病毒融合悬浮细胞时，将两种亲本细胞的悬液混合在一起离心，后将细胞沉淀悬于灭活的仙台病毒悬液中，使其进行融合，再洗去病毒，即可将融合的细胞加入选择培养液进行选择培养；

?融合贴壁细胞时，可将两亲本细胞混合培养，然后将病毒直接加入到混合培养物中，培养一定时间后加选择培养液进行选择；融合效率比悬浮细胞高。;2.化学融合剂诱发细胞融合;13;在相邻细胞膜紧密接触的部位，膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。接着可能是相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的脂质与脂质反应。

继之，脂质分子的扰动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合，形成很小的细胞质桥，之后细胞质桥逐渐扩大，两个细胞最终融合。;;16;PEG诱导鸡红细胞融合;PEG法植物原生质体的融合;3.电融合法;实际操作：

先把待融合的细胞或原生质体混合，取样置于100V/cm的高频交流电场中，在非均匀交流电场中形成串珠状排列；

完整烟草原生质体原生质体成串;再用1~5KV/cm直流电脉冲，微秒冲击细胞或原生质体的粘接点，细胞膜造成若干微孔，于是在膜之间形成通道，使细胞质得以交换；最后导致新的球状细胞的形成。;电融合法原生质体的融合结果;细胞核移植中的细胞融合;电融合技术的扩展：;?细胞化学聚集电融合：采用低浓度PEG、PHA或伴刀豆蛋白A等使??胞聚集接触，然后用电脉冲诱导细胞融合。

?磁－电融合：利用磁场使已表面磁化的细胞相互聚集接触，然后在用电脉冲诱导融合。;电融合的优点：;电融合的不利之处：;二、融合细胞的筛选;?大部分多核细胞在一周内死亡，只有少数异核细胞、尤其双核异核细胞会存活。并通过有丝分裂使两个不同亲本细胞的染色体合并在一个细胞核中，形成杂交细胞。

?利用酶缺陷型、营养缺陷型、温度敏感性、形态和行为等标志，建立了多种选择选择系统，最常用的是酶缺陷型HAT选择培养法。;1.HAT选择系统（酶缺陷型）;细胞内核苷酸的生物合成有两条途径：一条是主要途径，该途径中叶酸及其衍生物是必不可少的，氨基喋呤可抑制二氢叶酸还原酶活性，从而阻断细胞中DNA的合成；另外一条是补救途径，该途径需要两种酶参与。一种是HGPRT酶(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)，另一种酶是TK酶(胸腺嘧啶核苷激酶)。它们可以分别利用次黄嘌呤催化产生的肌苷酸及胸腺嘧啶核苷催化产生的脱氧胸苷来合成DNA。H、T为应急途径时提供外源核苷酸“前体”。;32;?在氨基喋呤存在时，阻断了核苷酸的从头合成IMP的途径，细胞只能通过HGPRT使次黄嘌呤酸化形成次黄苷酸，再依次转化为AMP及GMP，即通过“补救途径”依赖外源来合成核苷酸。因此，一个HGPRT－或TK－的细胞株不可能在含HAT的培养液中生长。但这样的细胞与能提供HGPRT或TK酶的细胞融合后，杂交细胞能在含HAT培养液中存活下来。;?如果融合细胞的亲本之一是一个能在体外长期生存的骨髓瘤细胞系，而另一个亲本细胞是体外增殖能力有限的正常细胞。如将长期培养系突变为HGPRT或TK酶缺陷型的细胞系，在和正常细胞融合后，未经融合或自身融合的骨髓瘤细胞在HAT培养液中死亡；未融合或自身融合的正常细胞在体外生存能力有限最终也死亡。因此存活下来的只有融合细胞。;2.基于营养缺陷型细胞所建立的筛选;36;一、单克隆抗体基本原理：;?每一个B细胞只分泌产生一种抗体，若能把此B细胞由脾脏中挑出来，单独培养成细胞株，则可得单一种类的抗体，只会对一种抗原决定簇反应，其专一性极高。大量培养此细胞株，即可有质量一定、纯度均一的抗体，此即为单克隆抗体。但B细胞在体外增殖能力非常弱或不增殖，故无法获得大量的单克隆抗体。;?骨髓瘤细胞易在培养基中生长；利用细胞融合法将骨髓瘤细胞永久生长的特性导入可生