溶菌酶实验-实验报告-第七组.docxVIP

溶菌酶实验-实验报告-第七组

溶菌酶的提取和系列性质测定

实验报告

学院：生物科学与工程学院

班级：

姓名：

学号：

组别：第七组

组员：

一、实验内容：

溶菌酶的提取和系列性质测定

在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种方法交替应用，才能得到较为满意的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离提纯效果。

溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。溶菌酶相对分子质量约为1.44×104，是一种强碱性蛋白质，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。在自然界中，普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中，植物卷心菜、萝卜、木瓜等，以蛋清含量最丰富，约为0.3%。

本实验用鸡蛋为原理，通过阳离子交换层析，硫酸铵沉淀，分子筛层析等步骤提取溶菌酶。

标准蛋白：SDS-低相对分子质量标准蛋白.

4、试剂配制

(1)0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；

(2)0.5mol/LNaOH；200ml

(3)0.5mol/LHCl；200ml

(4)含50%甘油的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；200ml，现配。

(5)含0.05mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；现配。

(6)含0.5mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；现配。

(7)含0.1mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；现配。

(8)测活缓冲液：含30mmol/LNaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；现配。

(9)底物溶液Ⅰ：40mg溶壁微球菌干粉溶于100mL测活缓冲液中；现配，公用。

(10)考马斯亮蓝G-250试剂：考马斯亮蓝G-250100mg溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤；公用。

(11)标准蛋白质溶液：用0.1mol/LNaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0配制1mg/ml牛血清清蛋白溶液；公用。

(12)底物溶液Ⅱ：300mg溶壁微球菌干粉溶于100ml测活缓冲液中；（生物技术班不用配制）。

(13)10mol/L脲，测活缓冲液配制；（生物技术班不用配制）。

(14)30%胶贮液：每100mL中含丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g；

(15)1.5mol/LTris-HClpH8.8；购买，不用配。

(16)0.5mol/LTris-HClpH6.8；购买，不用配。

(17)10%（W/V）过硫酸铵；现配。

(18)SDS电泳缓冲液：25mmol/LTris，0.192mol/LGly，0.1%（W/V）SDS；

(19)10%（W/V）SDS；公用。

(20)染色液：0.2g考马斯亮蓝R-250，42mL工业酒精，10mL冰醋酸，加蒸馏水至50mL；

(21)脱色液：5mL冰醋酸，45mL工业酒精，50mL蒸馏水；100ml

(22)保存液：7%冰醋酸；现配。

(23)2×上样缓冲液：购买，不用配。

0.5mol/LTris-HClpH6.82mL

甘油2mL

20%SDS2mL

0.1%溴酚蓝0.5mL

2-β-巯基乙醇0.5mL

蒸馏水2.5mL

三：实验步骤

1酶的提取

（一）样品的制备：

新鲜鸡蛋四个，破蛋壳取出蛋清，加入蛋清体积1.5倍的0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0），搅拌均匀，并调pH7.0（NaOH调pH），然后用八层纱布过滤，留取上清液，量取体积并记录，留0.4mL上清液（定为Ⅰ步骤样品）并加入0.4mL甘油-20