Thermo-Scientific-RevertAid-First-Strand-cDNA-Synthesis-Kit-K1621说明书(第一链cDNA合成试剂盒).docx

10

10

RevertAid第一链cDNASynthesis试剂盒

#K1621,#K1622

分析证明书

分析证明书

#K1621

Lot

质量掌握

承受100fg比照GAPDHRNA和比照引物进展RT-PCR反响，通过在1%琼脂糖上进展凝胶电泳和

溴

化乙锭染色显示得到足够量的496bp的产物

质量认证人：JurgitaZilinskiene

名目

页码

试剂盒组成 2

\l“_TOC_250004“存储条件 2

\l“_TOC_250003“产品说明 2

\l“_TOC_250002“留意事项 3

\l“_TOC_250001“操作步骤 6

\l“_TOC_250000“RT-PCR 6

合成cDNA用于克隆 7实

验比照 8问

题分析与解决 10

试剂盒成分

RevertAid

RevertAid 第一链cDNA合成试剂盒

RevertAid?M-MuLV反转录酶〔200u*/μl〕

RiboLock?RNA酶抑制剂(20u**/μl)5×反响缓冲液

20次

#K1621

25μl

25μl

100次

#K1622

120μl120μl

〔250mMTris-HCl(pH8.3),250mMKCl,20mMMgCl,50mMDTT〕

150μl

500μl

2

10mMdNTP混合物

Oligo(dT) 引物100μM,0.5μg/μl(15A

18

u/ml)

260

随机六聚体引物100μM,0.2μg/μl(6A260u/ml)

GAPDH正向引物,10μM

5’–CAAGGTCATCCATGACAACTTTG–3’

GAPDH反向引物,10μM

5’–GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’

比照GAPDHRNA

1.3kb3’-poly(A)tailedRNAtranscript,0.05μg/μl

无核酸酶高纯度水

50μl

25μl

25μl

250μl

120μl120μl

20μl

20μl

20μl

20μl

20μl

20μl

2x1.25ml

2x1.25ml

*一个单位的RevertAid?M-MLV逆转录酶在37℃10分钟将1nmol的dTMP转化为多核苷酸组分〔吸附在DE81上〕。

**一个单位的RiboLock?RNase酶抑制剂抑制5ngRNA酶A50%的活性。

存储条件

试剂盒中全部组分应存储在-20°C。比照用RNA可存储于-70°C以便长期使用。

产品说明

RevertAid?第一链cDNA合成试剂盒以mRNA或者总RNA为模板，高效合成第一链cDNA。本试剂盒使用RevertAid?M-MuLV反转录酶，它的RNA酶H的活性与AMV反转录酶相比较低。该反转录酶可耐受42-50°C温度，合成的cDNA片段长度达13kb。

试剂盒中含有RiboLock?重组RNA酶抑制剂，防止RNA降解，可耐受55°C高温。试剂盒同时含有oligo(dT)18和随机六聚体引物。随机六聚体引物与模板非特异性地结合，以总RNA

中任何RNA为模板合成cDNA。oligo(dT)

18

选择性和RNA3’poly(A)配对结合，只以有poly(A)尾巴的

mRNA为模板合成cDNA。使用本试剂盒也可承受序列特异性引物。合成的第一链cDNA能直接用作

PCR或荧光定量PCR的模板，其次链cDNA的合成或线性RNA扩增，

也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的试验，比方将标记好的第一链cDNA

作为杂交试验中的探针或者用于微阵列分析。

留意事项

避开核酸酶污染

RNA的纯度和完整性对于合成全长cDNA至关重要。RNA很简洁被RNA酶A降解，而RNA酶A广泛稳定地存在于试验室中。试剂盒中的全部成分都经过了无RNA酶的严格验证并保证不含有RNA酶。为防止污染，试验室和全部试验预备工作都必需保证没有RNA酶污染。

避开RNA酶污染的常规建议：

用DEPC处理试验用到的全部管子和枪头，或者购置已经证明无核酸酶的试验用具。

整个试验过程戴手套，由于皮肤是RNA酶的一个常见来源。并常常更换手套。

使用无RNA酶的试剂，即使是超纯水也要确保无RNA酶〔比方#R0581，无RNA酶的高纯度水〕

使用RNA酶抑制剂，比方试剂盒中供给的FermentasRi