实验十血痕的DNA 提取及STR 分析一、血痕DNA 提取在DNA.docx

实验十血痕的DNA提取及STR分析

一、血痕DNA提取

在DNA分析技术运用于实际检案的过程中，血痕是最常见的检材之一。对血痕提取DNA,再进行PCR扩增特定基因位点，然后电泳显色检测，这是常用的法医物证检验方法。目前，用于提取血痕DNA的方法很多，不同的方法有不同的优缺点，其适用的分析技术也有不同。而且，法医检案的实际应用过程中经常遇见不少问题，比如：微量血痕的DNA提取，血痕中含有过多的杂质等等。所以，在血痕DNA提取方面，我们应该了解多一点的方法。因此，本次实验介绍以下几种常用的血痕DNA提取的方法供同学们学习。分别是：chelex-100法、酚-氯仿法、碱性裂解法、以及这些方法的改良。

（--）Chelex-lOO法

.原理：

细胞中的DNA一般与蛋白质结合，抽提DNA的过程就是破碎细胞，去除与DNA结合的蛋白质、多糖、脂类（也包括去除其他核酸），最后分离、纯化所需的DNA的过程。在DNA的提取方法中，我们要用到蛋白酶K、SDSo蛋白酶K的作用是消化与DNA结合的蛋白质，释放DNA。SDS的作用是破坏细胞膜、核膜，并使组蛋白等从DNA分子上解联。Chelex-100法中，chelex是一种以亚氨二乙酸为吸附因子的苯乙烯与二乙基苯的共聚物，对多价金属离子有鳌合作用，可防止DNA在煮沸加热时被降解，同时在高温低离子强度下还有催化DNA释放的作用。这样既可减少DNA的损失，又可消除扩增中的一些抑制因素，因此血痕DNA采用chelex-100法，由于其快速、实用而被广大法医物证工作者所用。

.仪器设备与试剂：

仪器设备：

离心机、进样器、1.5mlEppendorf离心管、水浴锅、振荡器。

试剂：

灭菌去离子水，chelex-100

.方法：

检材用量：对于大量血痕（如血纱布），剪取约1xIcn?大小，不可过多否则会抑制PCR反应。如果血痕属微量血痕，可直接用进样器吸取20-40ul灭菌去离子水，然后在血痕处反复吹打，将血痕尽可能的洗下来并装入离心管中。

取适量血痕检材置1.5mlEP管中，加入11灭菌无菌水浸泡20min,10000rpm离心3min,用lOOOul进样器小心地吸去上清液。

力口5%chelex-100200ul,于水浴锅中56℃水浴30min,振荡混匀。

沸水中煮lOmin,取出后立即置于冰上3min,10000rpm离心Imin。上清液即为DNA提取液，可在2-6℃保存1个月，在-20C长期保存。

注意事项：

对部分陈旧、或污染有多量泥沙、载体吸附力强或色素深的血痕检材，经一次chelex-100的处理，仍不能扩增成功，这可能是由于以下几个原因：

①血痕过于陈旧，血色素无法溶解下来，使血色素对扩增的抑制增强，导致扩增失败。

②血痕受泥沙或载体色素的影响，使扩增受到抑制。

③血痕载体吸附力强，导致DNA提取率降低。

④血痕量太少，超出检验灵敏度。

针对以上几种影响因素，进行一些改良处理：

①对难于溶解的陈旧血痕，可加入1/10体积的10%SDS,促进血色素的溶解，易于洗涤,减少血色素对扩增的抑制。

②对受泥沙或载体色素影响的血痕，可对首次DNA提取液进行二次提取，使模板被稀释，减少载体的干扰，进一步去除模板中的扩增抑制物。

③对载体吸附力强的血痕，可增加浸泡时间，同时也可结合上述方法。

④对于量少而受污染的血痕，经上述处理后，再经超滤柱过柱浓缩，使模板DNA浓度达到可检测范围。在检案过程中，检材经常是受多种因素的影响，因此可综合利用上述几种处理方法。

（二）酚-氯仿法

.原理：

本实验采用酚、氯仿反复抽提，使与DNA结合的蛋白质解离、去除。氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。酚起萃取的作用。试验中还要用到异戊醇，有助于消除抽提过程中出现的泡沫。

.仪器设备与试剂：

仪器设备：

水浴锅、振荡器、离心机、进样器、1.5mlEP管

试剂：

灭菌去离子水、STE(氯化钠、Tris、EDTA)缓冲液、蛋白酶K、10%SDS、苯酚/氯仿/异戊醇混合物(25:24:1)、氯仿/异戊醇混合物(24:1)、5mol/L氯化钠、冰无水乙醇、70%乙醇

.方法：

取适量血痕检材置于1.5mlEP管中，加入1ml无菌水浸泡20min,10000rpm离心3min,弃去上清。

加入500)j1STE液悬浮沉淀物，加入20日110%SDS及10mg/ml蛋白酶K4|il,54℃水浴消化3小时。

离心取上清液至另一EP管中，加入500口1苯酚/氯仿/异戊醇混合物，振荡到出现絮状物，1OOOOrpm离心3min。

转移上层水相至另EP管中，加入氯仿/异戊醇混合物，振荡，10000rpm离心3min。

取上层水相，加入30口1