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实验十血痕的DNA提取及STR分析
一、血痕DNA提取
在DNA分析技术运用于实际检案的过程中,血痕是最常见的检材之一。对血痕提取DNA,再进行PCR扩增特定基因位点,然后电泳显色检测,这是常用的法医物证检验方法。目前,用于提取血痕DNA的方法很多,不同的方法有不同的优缺点,其适用的分析技术也有不同。而且,法医检案的实际应用过程中经常遇见不少问题,比如:微量血痕的DNA提取,血痕中含有过多的杂质等等。所以,在血痕DNA提取方面,我们应该了解多一点的方法。因此,本次实验介绍以下几种常用的血痕DNA提取的方法供同学们学习。分别是:chelex-100法、酚-氯仿法、碱性裂解法、以及这些方法的改良。
(--)Chelex-lOO法
.原理:
细胞中的DNA一般与蛋白质结合,抽提DNA的过程就是破碎细胞,去除与DNA结合的蛋白质、多糖、脂类(也包括去除其他核酸),最后分离、纯化所需的DNA的过程。在DNA的提取方法中,我们要用到蛋白酶K、SDSo蛋白酶K的作用是消化与DNA结合的蛋白质,释放DNA。SDS的作用是破坏细胞膜、核膜,并使组蛋白等从DNA分子上解联。Chelex-100法中,chelex是一种以亚氨二乙酸为吸附因子的苯乙烯与二乙基苯的共聚物,对多价金属离子有鳌合作用,可防止DNA在煮沸加热时被降解,同时在高温低离子强度下还有催化DNA释放的作用。这样既可减少DNA的损失,又可消除扩增中的一些抑制因素,因此血痕DNA采用chelex-100法,由于其快速、实用而被广大法医物证工作者所用。
.仪器设备与试剂:
仪器设备:
离心机、进样器、1.5mlEppendorf离心管、水浴锅、振荡器。
试剂:
灭菌去离子水,chelex-100
.方法:
检材用量:对于大量血痕(如血纱布),剪取约1xIcn?大小,不可过多否则会抑制PCR反应。如果血痕属微量血痕,可直接用进样器吸取20-40ul灭菌去离子水,然后在血痕处反复吹打,将血痕尽可能的洗下来并装入离心管中。
取适量血痕检材置1.5mlEP管中,加入11灭菌无菌水浸泡20min,10000rpm离心3min,用lOOOul进样器小心地吸去上清液。
力口5%chelex-100200ul,于水浴锅中56℃水浴30min,振荡混匀。
沸水中煮lOmin,取出后立即置于冰上3min,10000rpm离心Imin。上清液即为DNA提取液,可在2-6℃保存1个月,在-20C长期保存。
注意事项:
对部分陈旧、或污染有多量泥沙、载体吸附力强或色素深的血痕检材,经一次chelex-100的处理,仍不能扩增成功,这可能是由于以下几个原因:
①血痕过于陈旧,血色素无法溶解下来,使血色素对扩增的抑制增强,导致扩增失败。
②血痕受泥沙或载体色素的影响,使扩增受到抑制。
③血痕载体吸附力强,导致DNA提取率降低。
④血痕量太少,超出检验灵敏度。
针对以上几种影响因素,进行一些改良处理:
①对难于溶解的陈旧血痕,可加入1/10体积的10%SDS,促进血色素的溶解,易于洗涤,减少血色素对扩增的抑制。
②对受泥沙或载体色素影响的血痕,可对首次DNA提取液进行二次提取,使模板被稀释,减少载体的干扰,进一步去除模板中的扩增抑制物。
③对载体吸附力强的血痕,可增加浸泡时间,同时也可结合上述方法。
④对于量少而受污染的血痕,经上述处理后,再经超滤柱过柱浓缩,使模板DNA浓度达到可检测范围。在检案过程中,检材经常是受多种因素的影响,因此可综合利用上述几种处理方法。
(二)酚-氯仿法
.原理:
本实验采用酚、氯仿反复抽提,使与DNA结合的蛋白质解离、去除。氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。酚起萃取的作用。试验中还要用到异戊醇,有助于消除抽提过程中出现的泡沫。
.仪器设备与试剂:
仪器设备:
水浴锅、振荡器、离心机、进样器、1.5mlEP管
试剂:
灭菌去离子水、STE(氯化钠、Tris、EDTA)缓冲液、蛋白酶K、10%SDS、苯酚/氯仿/异戊醇混合物(25:24:1)、氯仿/异戊醇混合物(24:1)、5mol/L氯化钠、冰无水乙醇、70%乙醇
.方法:
取适量血痕检材置于1.5mlEP管中,加入1ml无菌水浸泡20min,10000rpm离心3min,弃去上清。
加入500)j1STE液悬浮沉淀物,加入20日110%SDS及10mg/ml蛋白酶K4|il,54℃水浴消化3小时。
离心取上清液至另一EP管中,加入500口1苯酚/氯仿/异戊醇混合物,振荡到出现絮状物,1OOOOrpm离心3min。
转移上层水相至另EP管中,加入氯仿/异戊醇混合物,振荡,10000rpm离心3min。
取上层水相,加入30口1
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