优血红蛋白的提取和分离专家讲座.pptx

本课题学习目标体验从复杂体系中提取生物大分子基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子基本原理。1、主要概念：①凝胶色谱法②电泳法③缓冲溶液④它们在血红蛋白提取中分别起到什么作用。主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质原理②电泳法分离样品原理③缓冲溶液组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法原理和方法4、课题难点：①样品处理②色谱柱填料处理和色谱柱装填。优血红蛋白的提取和分离专家讲座第1页

1.分离生物大分子基本思绪：选取一定物理或化学方法分离含有不一样物理或化学性质生物大分子。2.蛋白质分离和提取原理：依据蛋白质各种特征差异，如分子形状和大小、所带电荷性质和多少、溶解度、吸附性质和对其它分子亲和力等等，能够用来分离不一样种类蛋白质。一、血红蛋白提取和分离3、提取分离方法凝胶色谱法凝胶电泳法优血红蛋白的提取和分离专家讲座第2页

（一）凝胶色谱法（分配色谱法）2.凝胶：大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）组成多孔小球体，内部有许多贯通通道。依据被分离物质蛋白质相对分子质量大小，利用含有网状结构凝胶，来进行分离。1.概念：优血红蛋白的提取和分离专家讲座第3页

3.凝胶色谱法原理①当相对分子量不一样蛋白质经过凝胶时，相对分子量较小蛋白质轻易进入凝胶内部通道，旅程较长，移动速度较慢;②相对分子量较大蛋白质无法进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，旅程较短，移动速度较快。③依据特征是：蛋白质分子量大小。优血红蛋白的提取和分离专家讲座第4页

4.凝胶色谱法分离蛋白质原理和详细过程优血红蛋白的提取和分离专家讲座第5页

凝胶色谱法分离蛋白质过程动画演示

优血红蛋白的提取和分离专家讲座第6页

（二）缓冲溶液1.概念:在一定范围内，凡是能够抵制外加少许强酸或强碱影响使原来溶液PH值基本保持不变混合溶液。能够抵制外界酸和碱对溶液PH值影响，维持PH基本不变。2.作用:思索：说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3优血红蛋白的提取和分离专家讲座第7页

通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调整缓冲剂使用百分比就能够制得在不一样PH范围内使用缓冲液。4.提问：在本课题中使用缓冲液是:__________,利用缓冲液模拟细胞内PH环境，确保血红蛋白正常结构和功效，便于观察(红色)和科学研究(活性)磷酸缓冲液3.缓冲溶液配制:其目标是:优血红蛋白的提取和分离专家讲座第8页

（三）电泳：1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移过程。2.原理：①许多主要生物大分子，如多肽、核酸等都含有可解离基团，在一定PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反电极移动。③分离样品中各种分子带电性质差异以及分子本身大小，形状不一样，使带电分子产生不一样迁移速度，从而实现样品中各种分子分离。优血红蛋白的提取和分离专家讲座第9页

影响蛋白质分子运动速度原因?决定运动方向形成库仑力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√√√√3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。优血红蛋白的提取和分离专家讲座第10页

在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图优血红蛋白的提取和分离专家讲座第11页

聚丙烯酰胺凝胶电泳1、测定蛋白质分子量:惯用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂作用下聚合交联成含有三维网状结构凝胶。N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺交联共聚反应优血红蛋白的提取和分离专家讲座第12页

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中迁移率取决于它所带净电荷多少以及分子大小等原因。2.原理：SDS能使蛋白质发生完全变性。解聚成单条肽链，所以测定结果只是单条肽链分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷量大大超出了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不一样种蛋白质间电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子大小。3.SDS作用机理:优血红蛋白的提取和分离专家讲座第13页

用SDS测定蛋白质分子量方法使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量时，可选取一组已知分子量标准蛋白同时进行电泳，依据已知分子量标准蛋白电泳区带位置，能够测定未知蛋白质分子量。市场