不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳专家讲座.pptx

试验五

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳

（圆盘电泳）;圆盘电泳分离人血浆蛋白质

试验操作及注意事项;试验目标;注意事项：;;

主要过程

;试验分组（每人做一管，每4人配一份胶）

?

认清试剂（试剂和吸管对号、量器使用）

?

封管

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分离胶配制与灌胶

（浓度为6%，每组总体积为10ml，灌胶高度为7~8cm）

封正丁醇

（手法、高度、观察界面改变和判断凝固、时间掌握15min）;浓缩胶配制（浓度为3%，光聚合，每组总体积为8ml，灌胶高度为1.5cm,留1cm空加样）

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倒掉正丁醇

灌浓缩胶

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封正丁醇（观察界面，判断凝固时间）

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安装电泳槽（结构、原理、电流及电极方向、不漏水、除气泡）;样品处理并加样（20ul）

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加buffer

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电泳（浓缩胶时3mA/管，分离胶时2mA/管，距底1cm时停顿）

剥胶;固定（时间5min）;6%分离胶制备（每组四人）;3%浓缩胶制备（每组四人）;（一）

电泳基本原理及相关知识;?电泳概念;?电泳基本原理;?电泳分离蛋白质原理;?试验室中惯用到电泳方法

（以介质分类）;?电泳影响原因;（二）、聚丙烯酰胺凝胶电泳;;?合成聚丙烯酰胺凝胶两种方法;?聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质原理;;浓缩效应;浓缩胶还含有比分离胶更低pH

浓缩胶内缓冲溶液是Tris-HCl（pH6.7）,该pH远低于TrispK值(8.1)。

分离胶内缓冲溶液是pH8.9Tris-HCl，

电泳正负两极缓冲溶液均为pH8.3Tris-甘氨酸缓冲溶液。

在浓缩胶中，分子量小，且带有大量负电荷Cl-在凝胶中移动速率较快，而电荷较少且分子量较大甘氨酸移动速率较慢。因为二者在同一电场中，含有相同电流，由此形成电压梯度造成甘氨酸离子一直跟随在Cl-后面，带有负电荷蛋白质样品则浓缩在甘氨酸离子和Cl-之间向正极移动。

当样品进入pH8.9分离胶时，甘氨酸解离度增加，在电场中迁移率高于样品，蛋白质不再夹于两种离子之间向正极移动，这时蛋白质依靠分子筛效应和电荷效应进行分离。;分离主要依据;;?相关理论