基因的原核表达及检测.pptx

基因的原核表达及检测;试验目标;试验原理;目标蛋白质诱导表示

目标蛋白质纯化

目标蛋白质检测

;蛋白质表示：将克隆基因插入适当载体后导入宿主细胞表示大量蛋白质方法。

体内极难分析单个蛋白质作用

进行大量表示和纯化是为了在体外进行研究

应用于蛋白纯化、定位及功效分析等方面;图pET14b-His-TAT-EGFP-p38-16peptides融合蛋白

在Hela细胞中荧光显微镜检测（×400）;酵母表示系统

昆虫表示系统

哺乳动物细胞表示系统

表示蛋白含有正常活性、构象

技术难度较大、耗时、耗资;原核细胞表示系统菌株

菌株内源蛋白酶过多，可能会造成外源表示产物不稳定，所以一些蛋白酶缺点型菌株往往成为理想起始表示菌株。

堪称经典BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺点型，也是咱们非常熟悉表示菌株。

大名鼎鼎BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因，为T7表示系统而设计。;原核表示质粒构建

目标基因

表示载体;目标基因/DNA/PCR/酶切/Primer

例：

p38中抑制多肽16肽序列

GGAAGAACATTGTTTCCTGGTACAGACCATATTGATCAGTTGAAGCTC

F5’-ACGGATCCTAGGAAGAACATTGTTTCCTGGT-3’

R5’-ACGGATCCTTAGAGCTTCAACTGATCAATATGG-3’

5’端引物中AC是随机保护碱基，GGATCC是BamHI酶切位点，TA是为预防移码而引入两个碱基，随即是编码16肽前7个氨基酸碱基序列。

3’端引物中AC是随机保护碱基，GGATCC是BamHI酶切位点，TAA是终止密码子反向互补序列，随即是从编码16肽碱基序列最终一个碱基开始反向互补序列。;;表示载体

能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中;在基础骨架基础上增加表示元件，就组成了表示载体。

元件

开启子、终止子、核糖体识别序列

诱导性表示所需要元件

操纵子序列

调控基因

多克隆位点

融合Tag

复制起始序列

筛选标识/汇报基因

各种表示载体不一样之处

在于其表示元件差异。;开启子强弱是对表示量有决定性影响原因之一。从转录模式上看有组成型表示和诱导调控型表示。lac和Tac，PL和PR，T7是最常见开启子，

转录终止子

核糖体结合位点;用作分离载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽（Tag）。

标签位于表示载体多克隆位点N端或者C端，能够与目标基因融合表示（N端或者C端融合表示）。

当前常见标签有

组氨酸标签（His-Tag）

谷胱甘肽S转移酶（glutathioneStransferase）标签（GST-Tag）

硫氧还蛋白（thioredoxin,Trx）标签

麦芽糖结合蛋白（MaltoseBindingProtein,MBP）

蛋白质A（proteinA）

纤维素结合位点（cellulosebindingdomain）标签等。

普通对于小分子用较大Tag（如GST）以取得稳定表示；而普通基因多项选择择小Tag（如His）降低对目标蛋白影响。;筛选标识/汇报基因表示

抗药性基因，Amp是最常见筛选标识，kana，新霉素，四环素，红霉素和氯霉素。

抗性基因选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留心抗性基因编码酶是否和代谢物相互作用。

GFP（绿色荧光蛋白）是最常见汇报基因了，半乳糖苷酶，荧光素酶。

一些融合表示Tag也有汇报基因功效。;常见表示载体

pGEX系列载体是谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白表示系统载体。

PtacPromoter

Amp

pGEX-KG

pET系列载体是His6融合蛋白表示载体。

T7

Kana

pET-14b;基因的原核表达及检测;目标蛋白质诱导表示

lacIq（Lactose）

lacI是大肠杆菌中lac操纵子（Operon）调整基因，它所表示阻遏蛋白是lac操纵基因（Operator）抑制因子，抑制转录开启。

当有乳糖存在时，这种阻遏蛋白能与过量乳糖结合而失去对操纵基因抑制，使lac操纵子上结构基因lacZ（β-半乳糖苷酶)、lacY（透性酶)、lacA(乙酰基转移酶）得以正常表示，开启转录。

IPTG（异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷)作为乳糖类似物与lacI阻遏蛋白结合而使操纵基因不被抑制，所以IPTG经常作为lac操纵子诱导剂而使用。;AmpR;BamHI;原核表示诱导条件

IPTG浓度：0.01-5mmol/L

诱导时间：～3h

诱导温度：15-42℃;目标蛋白质纯化

破碎细胞

超声破碎

溶菌酶裂解

从细胞蛋白中纯化出GST和His融合蛋白

GST能