多克隆抗体的制备专家讲座.pptx

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陈伟伟;主要内容;原理;第一代抗体是传统抗体制备方法即利用抗原免疫动物后取得抗体，称为多克隆抗体（polyclonalantibody）；

第二代抗体是经过杂交瘤技术制备出针反抗原中某一抗原决定簇抗体称为单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)；

第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体(geneticengineeringantibody)。;多克隆抗体制备流程;

免疫原（immunogen）：

指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞抗原最主要性质是免疫原性（immunogenicity）.

免疫原种类：

天然抗原、人工合成抗原；

蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原。

;

细胞性抗原制备：

绵羊红细胞（SRBC）-溶血素；

细菌-抗菌抗体（动物免疫血清）。

可溶性抗原制备：

指蛋白质、多糖和脂类等。

;细胞破碎;超速离心分离：

是一个依据分离物质比重特点，经过差速或梯度密度离心，将分子大小不一样抗原颗粒分开方法，只适宜少数大分子物质分离。

选择性沉淀：

选择某抗原理化特征，采取对应沉淀剂或溶液环境，如：

核酸去除

盐析沉淀法

有机溶剂沉淀法

高分子聚合物沉淀法

50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白；

8%～12%PEG6000可沉淀IgG。

;超滤法：

利用孔径大小不一样特制薄膜对不一样分子大小抗原物质进行滤筛。

电泳

;精分离;判定纯化蛋白含量、相对分子质量、纯度以及免疫学活性。

蛋白含量—凯氏定氮（紫外光280nm等），Lowry

分子质量—电泳、质谱

蛋白纯度—电泳、HPLC

免疫原性—免疫印迹、免疫双扩散、免疫组化

蛋白活性—ELISA、XTT

蛋白结构—红外光谱、氨基酸测序

蛋白等电点—IEF;免疫佐剂

一些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原特异性免疫应答或改变免疫应答类型，这类物质称为免疫佐剂(immunoadjuvant)，简称佐剂。;佐剂种类

佐剂普通包含以下几类：

无机佐剂：如氢氧化铝、明钒等；

生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等；

人工合成佐剂：如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（polyI：C）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（polyA：U）；油剂：如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等；

纳米佐剂;弗氏佐剂（Freund’sadjuvant）

分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种：

前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化剂（羊毛脂或吐温-80）按1：1～1：5百分比混合而成；

后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在免疫动物时，先将弗氏佐剂与抗原等比混匀，制成“油包水”乳化液。;佐剂与抗原混合乳化方法：

研磨法

搅拌混正当;佐剂免疫生物学作用

增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性物质变成持久或强免疫原；

增强机体反抗原刺激反应性，提升首次应答和再次应答所产生抗体滴度；

改变抗体类型，使产生抗体由IgM型转变为IgG型；

引发或增强迟发性超敏反应。;佐剂作用机制

佐剂作用机制归纳起来主要有以下几个：

可增强抗原表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强抗原免疫原性。

佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原物理性状，形成抗原储存库，延长抗原在局部组织滞留时间，有利于抗原迟缓释放。

增强吞噬细胞吞噬作用（被佐剂吸附抗原易被吞噬细胞吞噬），促进反抗原处理，刺激淋巴细胞增生，从而增强和扩大免疫应答效应。;动物免疫;免疫方法

选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫路径、免疫次数、免疫间隔等原因。

免疫原剂量：免疫原接种剂量按免疫原性强弱、动物个体状态和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜过大，以免产生免疫麻痹。

;动物采血;免疫血清判定;玻片凝集试验;肥达试验（Widaltest）是用已知伤寒杆菌O、H抗原和甲、乙型副伤寒杆菌H抗原与病人血清做定量凝集试验，以测定患者血清中有没有对应抗体，依据抗体含量多少以及增加情况判断阳性。

此法普通用来帮助诊疗伤寒及副伤寒。

;ELISA;

特异性判定：抗体特异性判定惯用双向免疫扩散法、免疫电泳法。

纯度判定：

抗体纯度判定可采取SDS-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS）、双