重组及重组技术.ppt

感谢大家观看第93页,共93页，星期六，2024年，5月**************************左下角处有超级链接到配伍末端**********************（一）目的ＤＮＡ的分离获取——分化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。从基因组DNA文库和cDNA文库中获取目的DNA(见第20章)PCR法(见第20章)其他方法(见第20章)第61页,共93页，星期六，2024年，5月化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。第62页,共93页，星期六，2024年，5月组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合从基因组DNA文库获取目的基因第63页,共93页，星期六，2024年，5月限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库第64页,共93页，星期六，2024年，5月mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAATTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶Ⅰ碱水解TTTT第65页,共93页，星期六，2024年，5月（二）载体的选择与构建——选目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。目的：①获得某一目的基因或DNA片段②获得目的DNA片段所编码的蛋白质第66页,共93页，星期六，2024年，5月载体插入DNA片段宿主细胞质粒5~10kb细菌，酵母λ噬菌体载体~20kb细菌黏粒~50kb细菌BAC~400kb细菌YAC~3Mb酵母不同载体的克隆容量及适宜宿主细胞第67页,共93页，星期六，2024年，5月（三）目的DNA与载体连接——接方式：（1）单一相同黏端连接（2）不同黏端连接（3）通过其他措施产生黏端进行连接黏端连接第68页,共93页，星期六，2024年，5月BamHⅠ切割反应GGATCCCCTAGGT4DNA连接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连⑴单一相同黏端连接第69页,共93页，星期六，2024年，5月⑵不同黏端连接（定向克隆）EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4DNA连接酶15oC重组体第70页,共93页，星期六，2024年，5月由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。①人工接头(linker)连接⑶通过其他措施产生黏端进行连接第71页,共93页，星期六，2024年，5月人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ第72页,共93页，星期六，2024年，5月在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。②同聚物加尾连接第73页,共93页，星期六，2024年，5月5′3′3′5′载体DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或机械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nTT(T)nT3′5′5′3′3′5′3′A(A)nAA(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(