流式细胞术医学知识讲座专家讲座.pptx

流式细胞术（仪）;流式细胞仪--FACSAria;流式细胞仪—历史回顾;流式细胞仪/术—定义;是细胞或颗粒在液流中成有序队列经过激光术过程。

检测基于细胞或颗粒光学散射特点和荧光信号差异。

是单细胞水平上细胞或颗粒物理与化学特征分析。;流式细胞仪—系统组成;流式细胞仪—液流系统;流式细胞仪—光学系统;FSC

细胞或颗粒体积成正比

正圆形细胞或颗粒表面积成正比;;滤光片/双色性滤光片

长通短通带通;流式细胞仪—电子系统;流式细胞仪—软件系统;流式细胞仪—研究对象;流式细胞仪—染色;荧光一抗

一抗+荧光二抗

直接染抗原染料（PI、EB）

;流式细胞仪—对照;阴性对照;流式细胞仪—荧光赔偿（单管单标识）;例：一个样本只有FITC染色PE不染色，检测FITC和PE检测器都开着。;;单管双标识;流式细胞仪—分选;流式细胞术应用;细胞调亡检测

细胞会缩水变小，细胞内部颗粒会变多

细胞质膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻造成细胞膜不对称性消失

蛋白水解酶——Caspase酶活化

核酸内切酶活化造成DNA断裂

线粒体膜电位改变;细胞质膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻造成

细胞膜不对称性消失;核酸内切酶活化造成DNA断裂;细胞调亡检测—caspase酶活化;细胞调亡检测—caspase酶活化;核酸内切酶活化造成DNA断裂;线粒体膜电位改变;;液相蛋白芯片技术－BDCBAFlexset;样本制备好坏与流式细胞仪结果？;固体组织机械性解联

基本程序

新鲜组织→组织分散→原始悬液→过滤→离心→洗涤→细胞悬液细胞计数和活性检测→细胞固定

注意事项

在4℃培养液中处理细胞和保留;固体组织酶消化性解联几个关键点

消化酶组成：2.5mg/ml胰蛋白酶，0.5mg/ml胶原酶II和20μg/mlDNA酶I

组织消化条件37℃，1h，温和振荡

;培养细胞细胞悬液制备

钙螯和法

5mMEDTA30min

优点：细胞表面抗原保留完好

缺点：耗时，低回收率，减低细胞存活率

酶消化法

胰酶/EDTA(0.02-1%/5mM），1-10min

优点：快速，高回收率，高细胞存活率

缺点：可能显著改变细胞表面抗原表示;血液标本抗凝剂选择;染色前样本储存时间

标准越短越好

保留温度4℃或RT

适当储存方式取决于细胞种类，分析类型和样本处理方法

即时各种细胞功效检测，髓系细胞免疫表型

≤1h，4℃单核细胞表面抗原分析

＜2h，4℃嗜酸性粒细胞表面抗原分析

≤72h，淋巴细胞免疫表型与DNA倍数分析;

样本制备过程中，防止温度重复升降

尤其是测细胞功效时候;荧光抗体要进行分装

使用前要15000g离心除去聚集体

Fc受体阻断策略

用非特异性抗体进行前孵育

目标抗体染色时，加入超饱和非特异性抗体;荧光素选择

荧光素明亮度（和分子量大小相关）

PE＞PE-Cy5＞PE-TexasRed＞APC＞FITC

选择最明亮荧光素标识低密度抗原

选择FITC标识细胞核抗体;样本染色后洗涤还是不洗涤？

取决于以下得失平衡

洗涤：洗涤过程中会引发假象？

不洗涤：增加背景染色？

洗涤是必要步骤

检测细胞表面抗体结合

悬浮介质含大量可溶性抗原;

HO染色标本不适合在FACSAria上检测

因为该型号机子上没有352nm激发光;

Thankyouforyourlistening!