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5.分子生物学研究法（上）——

DNA、RNA及蛋白质操作技术5.1重组DNA技术回顾5.2DNA基本操作技术5.3RNA基本操作技术5.4SNP的理论与应用5.5基因克隆技术5.6蛋白质组与蛋白质组学技术5.1重组DNA技术回顾分子生物学的三大成就：①40年代确定了遗传信息的携带者；②50年代提出了DNA的双螺旋结构模型和半保留复制机制；③60年代提出了“中心法则”和操纵子学说，破译了遗传密码。重组DNA和核苷酸序列分析技术推动了分子生物学的发展，重组DNA的核心是用限制性内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接。限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease，RE）是能够识别DNA上的特定碱基序列（4~8bp，回文结构），并在识别位点或其周围切割双链DNA分子的一类内切酶，产生具有粘性末端或平末端的片段。RE的一个活性单位（1U），是在50μl的反应液中，37℃下，经过1小时反应，将1μgDNA完全分解所需要的酶量。RE的浓度：5~20U/μl。Star（星号）活性：在非最适的反应条件下（高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、高pH值等），有些RE可能会切断与原来识别序列不同的位点，这种特殊的活性，称为Star活性。保存方法：50%甘油缓冲液中，保存温度-20℃，避免结冰。DNA的酶切反应1)建立反应体系2)轻弹外壁以混匀，并短暂快速离心，使液体沉下。3)将混合反应物置于37℃水浴锅中，反应1-3小时。4)电泳观察酶切结果。DNA连接酶（ligase）：通过合成相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，修复缺口或催化黏合完全分离的两个DNA片段。类型：大肠杆菌DNA连接酶、噬菌体T4DNA连接酶。连接反应1)建立反应体系，轻弹外壁以混匀，短暂快速离心，使液体沉下。2)4℃或16℃连接过夜。获得了外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA后，还要通过细菌转化将重组载体导入宿主细胞（E.coli），让重组载体增殖。5.2DNA基本操作技术5.2.1核酸凝胶电泳技术5.2.2细菌转化与目标DNA分子的增殖5.2.3聚合酶链反应技术5.2.4实时定量PCR5.2.5基因组DNA文库构建5.2.1核酸凝胶电泳技术原理：某种分子放到电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。迁移率：这种分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数（分子大小、极性、介质黏度的函数）成反比。迁移率取决于分子大小和构型。分子量越大，迁移率越小。相同分子量的超螺旋环状DNA（cccDNA，SCDNA）迁移率＞线性DNA（LDNA）＞开环DNA（OCDNA）。类型：琼脂糖（agarose）凝胶电泳、聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶电泳。琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成电泳介质，密度由其浓度决定。聚丙烯酰胺是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂TEMED（四甲基乙二胺）的作用下聚合而成。凝胶的分辨能力与凝胶的类型和浓度有关，琼脂糖凝胶分辨的范围在0.2-50kb，要分辨更小的DNA片段，要用聚丙烯酰胺凝胶，分辨范围1-1000bp。凝胶浓度高低影响其孔隙大小，浓度越高，孔隙越小，分辨能力越强。电泳缓冲液：TAE、TPE、TBE，作用：①稳定体系的pH值；②使溶液具有一定的导电性；③EDTA可螯合Mg2+，抑制DNA酶活性，还可防止Mg2+与核酸生成沉淀。载样缓冲液：0.25%溴酚蓝、40%蔗糖水溶液。作用：①增加样品密度；②使样品带颜色；③可预测泳动速率。Marker：分子量不同的DNA片段，作用类似于标尺。步骤：封胶板，插梳子→配胶→加EB→灌胶→胶凝后拔梳，放入电泳槽，加缓冲液→加样→插电极→电泳→取胶→观察照相琼脂糖凝胶电泳中，加入适量溴乙啶（EB）染料，EB是扁平分子，能插入到核酸分子的相邻碱基之间，在300nm波长的紫外线照射下发出荧光。荧光强度与DNA片段的大小成正比。聚丙烯酰胺凝胶电泳在电泳后用硝酸银进行染色。Ag+先与核酸形成复合物，再用甲醛使Ag+还原为银颗粒而呈现黑褐色。脉冲场电泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE）对于50kb的DNA分子，用脉冲电场凝胶电泳进行分离。用交替变换方向的两个电场施加在凝胶上，DNA分子的迁移方向随着电场方向的周期性变化而不断改变，重新定向时间小于电场变化周期的DNA分子将按其大小被分离。可分