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用改变程序的供体染色质或供体细胞克隆哺乳动物的方法

专利名称：用改变程序的供体染色质或供体细胞克隆哺乳动

物的方法

背景技术：

概括地说，本发明描述了改进的克隆哺乳动物的方法、以及

将染色体、细胞核或染色质团插入受体细胞的方法。

哺乳动物的克隆能够产生多个DNA内容等同的哺乳动物。用

于产生这些哺乳动物的供体遗传物质可以通过选择或基因

工程方法获得，从而使克隆的哺乳动物具有所要求的性质，

例如对疾病抗性的增强。但遗憾的是，用供体的体细胞克隆

哺乳动物的有效率一般是很低的，只能导致约1-2％的核移

植胚胎发育至足月(Polejaeva等，Nature40786-90，2000)。

克隆的一个严重问题是后代在妊娠中晚期的丢失或存活率

低。因此，需要有更有效的方法来克隆哺乳动物。这些改进

的方法有可能减少产生多个存活后代所需要的成本和时间。

发明概述本发明的目的是提供改进的克隆哺乳动物的方法。

尤其是，这些方法包括将供体细胞核凝聚成染色质团，使细

胞核的成分，例如转录因子，可以释放出来，该转录因子可

促进某些基因的转录，而这些转录对核移植的胚胎发育成存

活的后代来说是不希望有的。在有关的方法中，透化细胞与

改变程序(reprogramming)的培养基(如细胞提取物)一起温

育，使某些因子进入细胞，或从细胞去除，然后使该透化细

胞的原生质膜重新封闭而将所需要的因子包入，并恢复该细

胞膜的完整性。必要时，可重复这些方法中的任何步骤1次

或多次，或可连续进行不同的改变程序的方法，以增加改变

程序的程度，导致克隆的胎儿具有更大的存活能力。本发明

还提供产生嵌合胚胎的方法，该嵌合胚胎中，一些或全部的

胎盘组织来自于一种遗传源，而大部分胎儿组织来自另一种

遗传源。这些嵌合胚胎的胎盘异常性较少，从而使其存活率

增加。此外，还建立了一种新的将染色质团或细胞核插入受

体卵母细胞中的方法，该方法包括致融合(fusigenic)化合

物的使用。

因此，第一方面，本发明提供一种克隆哺乳动物的方法。该

方法包括(a)将包含少于4套同源染色体(即含有少于2对完

全染色单体)的供体细胞核在使染色质团形成而不引起DNA

复制的条件下进行温育，(b)将染色质团插入去核的卵母细

胞，从而形成核转移卵母细胞，以及(c)在使核转移卵母细

胞或胚胎发育为胎儿的条件下，将该核转移卵母细胞或由该

核转移卵母细胞形成的胚胎转移至宿主哺乳动物的子宫。在

优选的实施方案中，在使细胞核或细胞质的成分，例如转录

因子、阻遏蛋白或染色质重塑蛋白能加入细胞核或所产生的

染色质团中，或从其中除去的条件下，将供体细胞核与改变

程序的培养基(如细胞提取物)一起温育。优选供体细胞核在

使染色质团形成的条件下与一种或多种下述的物质接触在

抗NuMA抗体存在或不存在下的有丝分裂提取物、去污剂和/

或盐的溶液、或蛋白激酶溶液。在其他优选的实施方案中，

重建的卵母细胞或所产生的胚胎的核纤维蛋白A，核纤维蛋

白C，或NuMA蛋白的表达水平比细胞数相同并来源同一物种

的对照卵母细胞或对照胚胎的相应表达水平高不到5倍。

在相关的方面，本发明提供另一种克隆哺乳动物的方法。该

方法包括使透化细胞与改变程序的培养基(例如细胞提取物)

在使某种因子(例如，细胞核或细胞质的成分，如转录因子)

能从透化细胞的细胞核、染色质团、或染色体中除去、或将

某种因子加入该细胞核、细胞质团、或染色体中的条件下温

育，从而形成改变程序的细胞。将该改变程序的细胞插入去

核的卵母细胞，然后将所产生的卵母细胞或由此卵母细胞形

成的胚胎，在使卵母细胞或胚胎能发育成胎儿的条件下，转

移至宿主哺乳动物的子宫中。在优选的实施方案中，该透化

细胞在使染色质团形成的条件下与一种或多种下述物质接

触在抗NuMA抗体存在或不存在下的有丝分裂提取物、去污

剂和/或盐的溶液、或蛋白激酶溶液。还有一个实施方案中，

透化细胞与分裂间期的改变程序培养基(例如分裂间期的细

胞提取物)一起温育。在另外还有一个优选的实施方案中，

透化细胞中的细胞核仍保持膜包围的状态，而且核中的染色

体在与该分裂间期的改变程序培养基温育期间不凝聚。在某

些实施方案中，透化细胞在改变程序培养基中温育不会引起

该细胞的DNA的复制，或者仅引起少于50、40、30、20、10

或5％的细胞的DNA复制。在其他实施方案中，透化细胞在

改变程序培养基中的温育至少引起60、70、80、90、95、

或100％的细胞的DNA复制。在各种实施方案中，通过使完

整细胞与去污剂，如毛地黄皂苷、或细菌毒素，