目基因克隆及基因文库构建.pptxVIP

从生物体基因组中分离克隆目标基因，是分子克隆技术取得应用前提。进而，才能对目标基因进行以下研究：

确定其表示调控机制和生物学功效；

建立高效表示系统，构建含有经济价值基因工程菌（细胞）；

将目标基因在体外进行必要结构功效修饰，然后输回细胞内改良生物体遗传性状，包含人体基因治疗。;普通来说，目标基因克隆策略分为两大类：

一类是利用PCR扩增、化学合成等技术体外直接合成目标基因，然后将之克隆表示。

另一类是构建感兴趣生物个体基因文库，即将某生物体全基因组分段克隆，然后建立适当筛选模型从基因组文库中挑出含有目标基因重组克隆。

鸟枪法构建基因组文库

cDNA法构建cDNA文库;目标基因克隆

基因分离物理方法

鸟枪法

cDNA法

PCR法

化学合成法

基因文库构建

鸟枪法

cDNA法;一、目标基因克隆;（一）基因分离物理方法;用限制性内切酶将基因组DNA进行切割，得到很多在长度上与普通基因大小相当DNA片段（1000bp），然后，将这些片段混合物随机地重组入适当载体，转化后在受体菌（如：E.Coli）中进行扩增，再用适当筛选方法筛选出目标基因。;1.鸟枪法克隆目标基因基本策略;2.鸟枪法克隆目标基因基本步骤;3.鸟枪法操作改进;比如，已知某目标基因位于1.8kbSalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.0kb大小区域内凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接。;冻融法

滤纸法

吸附法

低融点凝胶法

溶解法;13;4.鸟枪法克隆目标基因不足;（三）cDNA法克隆目标基因;1.cDNA法克隆目标基因基本策略;反转录酶：AMV（来自禽成髓细胞瘤病毒）

MMLV（来自Moloey鼠白血病病毒）

引物：Oligo（dT）和随机引物

Oligo（dT）引导cDNA合成

是指Oligo（dT）引物与mRNA3‘末端poly（A）配对，引导反转录酶以mRNA为模板合成第一链cDNA。这种cDNA合成方法在cDNA文库构建中应用极为普遍，其缺点是因为cDNA末端存在较长poly（A）而影响cDNA测序。

随机引物引导cDNA合成

采取6－10个随机碱基寡核苷酸短片段来锚定mRNA并作为反转录起点。因为随机引物可能在一条mRNA链上有???个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较轻易合成专长mRNA分子5端序列。

随机引物cDNA合成方法不适合构建cDNA文库，普通用于克隆特定mRNA5末端，如RT-PCR和5-RACE。;（2）cDNA第二链合成;DNApoldNTPs;dCTP;（3）双链cDNA克隆;22;（1）完备分离程序;（2）特异分离程序;（3）差异分离程序;;3.cDNA法克隆目标基因不足;（四）PCR法克隆目标基因;PCR技术反应周期包含三个步骤：

高温变性：经过加热使得复制双螺旋DNA变性分离为单链，作为模板。（91℃，1分钟）。

低温退火：（约50℃，1分钟）使专门设计一对寡核苷酸引物在此低温条件下分别与单链模板DNA两端互补区段互补结合。

适温延伸：将反应混合物温度上升到72℃，保温1分钟。;;31;PCR原理图;由TaqDNA聚合酶扩增PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为TaqDNA聚合酶对dATP含有优先聚合活性。因为该突出碱基存在，克隆时即能够采取TdT末端加同聚尾方法与载体拼接，也能够使用专门T载体克隆。;（五）化学合成法克隆目标基因;1.化学合成法基本策略;②补丁延长法：;③大片段酶促法：;上述三种方法各有利弊：

化学合成DNA单片段愈短，收率就愈高，但因为化学合成份额较大，成本较高；

在大片段酶促法合成目标基因时，即使化学合成份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成收率极低。比如，每聚合一个单体产物收率为95%，则合成50个碱基DNA单链大片段总收率只有7.7%。;;某段连续氨基酸序列全部可能DNA序列

;;化学合成单元操作;3.基因化学合成优点

能够合成细菌偏爱密码子

能够定向改变个别氨基酸

能够在两端加上需要限制酶切点

能够经过自动化仪器合成;;二、基因文库构建;1.基因文库基本概念;（2）基因文库构建基本策略;;;（4）基因文库完备性;（5）基因文库质量标准;（1）基因组DNA制备;（2）基因组DNA切割;（3）载体和受体选择;在基因组文库构建过程中，大量体系连接前先使用小体系连接来寻找最正确百分比！

方法一：粘末端连接

方法二：人工接头法;56;（6