乙肝病毒cccDNA的基础研究和临床应用进展 PPT.ppt

实时荧光定量PCR的原理标准曲线方程YCt=42.0827-3.5554logXcopy相关指数：R2=0.995灵敏度至少可以达到103copy/ml我们的结果：选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA·同样存在PCR产物自身退火引起的rcDNA非特异性扩增的问题·由于灵敏度较普通PCR高，假阳性率比普通PCR更高缺陷：选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA质粒标准品107copy/ml3.5×108copy/ml携带者血清质粒标准品105copy/ml105~107copy/ml携带者血清选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA解决方案特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法酶切纯化cccDNA采用绿豆核酸酶或ATP依赖的plasmid-safeDNA酶选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)?侵入者探针法（Invaderassaay）3.嵌合引物荧光PCR法现有的几种cccDNA检测技术简介2.侵入者探针法(Invaderassay)两个体系：两种特殊的探针：invaderprobe和primaryprobe，后者含与待测模板无关的5’侧翼的碱基片段。荧光共振能量转移系统：被核酸内切酶Ⅰ(cleavase,裂解酶)特异地切割5’侧翼碱基片段作为第二个invader，与荧光共振能量转移盒（FRETC）结合，裂解酶切割FRETC上含有荧光基团的短臂，发出荧光信号。特点：一个模板可以重复使用，每“结合—裂解—结合—裂解”一次为一个循环，每循环一次产生一个荧光信号，呈线性信号放大侵入者探针法定量检测cccDNA的优缺点优点：线性信号放大，特异性比荧光PCR法强缺点：灵敏度低：104copy/ml1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者分析法（Invaderassaay）?嵌合引物荧光PCR法现有的几种cccDNA检测技术简介3.嵌合引物荧光PCR法Shao,etal.JVirolMethods2003；112：45-52+PNN：与HBVDNA非同源片段5’N5’3’3’p+rcDNAcccDNAPNNP25’3’5’3’3.嵌合引物荧光PCR法嵌合引物荧光PCR的优缺点优点：克服了荧光PCR法的部分缺陷，灵敏度比侵入法提高缺点：仍不能完全避免待测标本中存在的rcDNA被非特异性扩增无论是选择性荧光PCR，还是侵入者探针法或嵌合引物荧光PCR，本身都不能解决在高rcDNA背景条件下的假阳性问题，必须结合抽提分离、酶切纯化等步骤，以提高特异性。三、影响cccDNA池的因素1.cccDNA池的自身恒定?cccDNA池：感染肝细胞核内HBVcccDNA的含量在无外来干扰的情况下保持恒定(5－50copy/cell)?病毒自身调节：关于病毒的进化关于病毒的“思维”病毒自身的调节?外来压力：打破病毒含量自身恒定的结果2.抗病毒药物对cccDNA的影响现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类似物以及中药氧化苦参碱，可以一过性地减少cccDNA，但均不能彻底清除cccDNA细胞核内cccDNA含量的相对稳定性，决定了长疗程抗病毒治疗的必要性预测SVR治愈时不必要一定是0，与HBsAg不同步抗病毒药物研究者模型干扰素Schultz等原代鸭肝细胞拉米夫定Mason等土拨鼠Addison等北京鸭阿德福韦Dandri等土拨鼠Delmas等北京鸭L-Fd4CZoulim等原代鸭肝细胞抗病毒药物对cccDNA的影响（文献举例）抗病毒药物对肝组织HBV共价闭合环状DNA(ccCDNA)的影响方法7l例HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者分别接受48周的拉米夫定一干扰素序贯治疗、单用拉米夫定治疗和24周的干扰素治疗，随访24周。检测治疗前、后肝组织HBVDNA和cccDNA水平；检测治疗前、后及停药24周时的血清HBVDNA和ALT水平。比较C、B基因型HBV感染患者肝组织HBVDNA和cccDNA水平。陆海英,庄立伟,于岩岩.中华肝脏病杂志2008,3;3(16):198-203结果治疗结束时，序贯治疗、拉米夫定治疗和干扰素治疗组患者肝组织HB