Trm61的表达纯化的开题报告.docxVIP

大肠杆菌UbiG的结构探索及人源Trm6/Trm61的表达纯化的开题报告

本次研究计划探索大肠杆菌UbiG的结构，并对人源Trm6/Trm61进行表达纯化。具体研究内容和计划如下：

一、研究背景

UbiG是大肠杆菌中催化NADPH和前驱物4-羟基苯丙酮酸（4-HPA）反应生成尿嘧啶前体UBA的一种酶。UBA是合成泛素的中间体，因此UbiG在泛素代谢途径中具有重要作用。目前，关于UbiG的结构和功能机制尚未完全阐明。

Trm6/Trm61是一组恒温双股RNA甲基转移酶，拥有以tRNA黏合二聚物形式催化反应的独特特征，并参与tRNA的修饰过程。同时，Trm6/Trm61也参与基因信使RNA的异构化修饰。Trm6/Trm61在基因表达调节中发挥重要作用，但其结构和机制仍未得到全面解析。

二、主要研究计划

1.UbiG的结构探索

（1）UbiG基因的克隆和表达：通过PCR扩增大肠杆菌中的UbiG基因，将其克隆至表达载体中，经细胞培养后利用平板筛选出表达阳性的菌落。

（2）His-tag亲和纯化：将表达的蛋白质在平衡缓冲液中与Ni-NTA亲和树脂结合，洗涤非特异结合蛋白，通过梯度洗脱得到纯化的蛋白质。

（3）SDS分析：通过SDS分析纯化后的UbiG蛋白质的纯度和分子量。

（4）折叠验证：通过循环二色谱和荧光光谱检测纯化后的UbiG蛋白的折叠状态。

（5）结构分析：通过X-ray衍射技术和核磁共振技术，确定UbiG的三维结构以及其与底物4-HPA结合的方式。

2.Trm6/Trm61的表达纯化

（1）Trm6和Trm61基因的克隆和表达：通过PCR扩增人源Trm6和Trm61基因，将其克隆至表达载体中，经细胞培养后利用平板筛选出表达阳性的菌落。

（2）His-tag亲和纯化：将表达的蛋白质在平衡缓冲液中与Ni-NTA亲和树脂结合，洗涤非特异结合蛋白，通过梯度洗脱得到纯化的蛋白质。

（3）SDS分析：通过SDS分析纯化后的Trm6和Trm61蛋白质的纯度和分子量。

（4）折叠验证：通过循环二色谱和荧光光谱检测纯化后的Trm6和Trm61蛋白的折叠状态。

三、预期结果与意义

本研究预期通过X-ray衍射和核磁共振技术确定UbiG的三维结构，解析其与底物4-HPA结合的方式，为进一步研究泛素代谢途径提供参考。同时，成功表达纯化人源Trm6和Trm61，为后续研究其结构与机制打下基础，同时也为研究基因表达调控提供新的线索。