用于选择含有编码针对毒性分子的解毒剂蛋白的序列的重组克隆的方法.pdfVIP

用于选择含有编码针对毒性分子的解毒剂蛋白的序列的重

组克隆的方法

专利名称：用于选择含有编码针对毒性分子的解毒剂蛋白的

序列的重组克隆的方法

技术领域：

本发明属于重组DNA技术的领域。

更准确地说，本发明涉及一种方法，一种核酸构建体，一种

载体和一种用于选择重组克隆的细胞，该重组克隆含有编码

针对毒性分子的解毒剂蛋白的序列。

背景技术：

及现有技术有可能将DNA插入片段克隆到载体中而不需要选

择重组体，却需要花费时间进行利用放射性标记探针的杂交

鉴定，通过限制性酶切小规模制备的质粒进行筛选或在有

X-Gal存在的条件下基于α互补失活进行筛选(蓝/白筛选)。

这些用了十多年的方法并不适应大规模的克隆计划，该计划

将在完整基因组测序计划之后出现。可获得的序列信息已经

迅猛增加而且在将来还将进一步增加。

为了评价已被鉴定的编码序列的生物学功能，必须对生物体

基因组中的其相应基因进行特异性突变(缺失或修饰)(例如

在剔除小鼠中)，以便研究与引入的突变相关的表型。突变

的特异性是由导向载体(在大肠杆菌中构建的)所给予的，所

述导向载体含有同源重组臂。

如果测序技术的发展能够满足测序基因数目迅猛增加的需

要，为了获得重组克隆和得到相应基因功能的相关资料而对

基因进行大规模的克隆和亚克隆仍然是功能性基因组计划

的限制性步骤。

对每种基因进行克隆和亚克隆是“功能性基因组计划”的瓶

颈。因此需要加快这些进程的新克隆方法。

由于重组体的鉴定是一个限制性步骤，因此很清楚需要进行

重组体的正选择来由传统的方法进展到进行高产量克隆，从

而能够处理成千上万的基因。

已经提出了能够直接选择(正选择)重组菌株的克隆载体(例

如，参见Pierce等，1992；Kuhn等.1986)。然而，大多数

克隆载体表现出下列缺点(i)它们不能被用来引入大的核苷

酸片段，(ii)它们不易操作处理，以及(iv)它们不能由微生

物以多拷贝来进行制备且不导致所述微生物死亡。

而且，传统的限制性酶切和连接酶反应可以被位点专一性重

组所取代，而且重组体可以通过所感兴趣的插入片段取代

ccdB基因(毒物/解毒剂基因家族的成员)来进行选择(美国专

利US5,910,438，US6,180,407和国际专利WO99/58652)。

含CcdB的载体比其它正选择系统具有下列主要优势i)其选

择基因小(ccdB303bp)，ii)所述载体能在一种宿主中扩增，

该宿主含有一个赋予其针对CcdB毒物的总体抗性的突变

(gyrA462抗性菌株；Bernard和Couturier，1992)。由于大

肠杆菌是大多数分子克隆技术方案所采用的宿主，所以研制

能够增强和拓宽克隆可能性范围的新型系统是非常重要的。

利用CcdB的正选择技术已被用来构建适于特殊目的的新载

体PCR克隆载体(Gabant等，1997)，适于细菌遗传学的载体

(Gabant等，1998)，而且最近采用一种属于CcdB家族的kid

基因设计了新型的克隆载体(Gabant等，2000和WO01/46444)。

CcdB基因用途的另一个实例由美国专利US5,888,732给出。

该文献公开了被称作″通道系统(theGatewaysystem)″的

克隆方法的基本原理。在该方法中，传统的限制性酶切和连

接酶反应被位点专一性重组位点所取代而且通过插入目的

基因致使ccdB基因失活(通过缺失)来选择重组体。该方法

使得生物体的所有基因通过自主亚克隆而快速并有效地由

一个载体转移到不同的载体(即表达载体)。所产生的亚克隆

保留了允许进行翻译融合的定向以及读框(有关综述参见

Hartley等，2000)。

然而，所述技术是基于可反选择基因，需要使用rpsl，

tetR，sacB或ccdB可反选择基因，从而产生一种无缝的第

二轮产物，该产物没有从第一轮重组中携带上″疤(scar)″。

由于目的重组只是若干种反选择压力方案中的一种，所以反

选择(用于选择毒性基因的失活或缺失)通常比正选择(新性

能的获得)效率低。任何消除可反选择基因表达的突变事件

也将在反选择压力下生长。

因此对于罕见的遗传事件(其发生频率与可反选择基因的突

变失活相当)来说，需要对来自第二轮反选择策略的候选物

进行筛选从而找出所需的重组事件。

在实践中，由于存在着一些仍然不确定的因素，目的产物与

不需要的产物之比的变化范围似乎很宽(从＜1％至15％

-85％)(MuyrersG.P