NYT 2249-2012 菠萝凋萎病病原分子检测技术规范.docxVIP

ICS65.020

B16

中华人民共和国农业行业标准

NY/T2249—2012

菠萝凋萎病病原分子检测技术规范

Technicalspecificationofmoleculardetectionforpineapplemealybugwiltpathogen

2012-12-07发布2013-03-01实施中华人民共和国农业部发布

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NY/T2249—2012

菠萝凋萎病病原分子检测技术规范

1范围

本标准规定了菠萝凋萎病病原(包括菠萝凋萎伴随病毒和菠萝杆状病毒)的分子检测方法。本标准适用于菠萝种苗及大田植株中菠萝凋萎伴随病毒和菠萝杆状病毒的定性检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修政出适用于本文件

SN/T1193基因检验实验家技术要求

3术语和定义

下列术语和定义适用文本文件

3.1

菠萝凋萎病病原pathogenofpineapplemealybugwill(Pvw)

包括菠萝凋萎伴随病毒(Pineapplemealybugwilir-Lsociatedtirus.PMwav)和菠萝杆状病毒

(Pineapplebacillifonciris,PBCov),其中菠萝凋萎伴随病毒包括菠萝凋萎伴随病毒1号(PMWaV-

1),菠萝凋萎伴随病毒2号PMWaV=2)和菠萝凋萎伴随病毒3号(PMWaV-3)。

位、寄主范围、危害症状及地理分布参见A.1~A.4。

3.2

热休克蛋白-70二heatshockprotein70,HSP-70

该病害病原的分类地

工

分子量约为70ku的类热休克蛋白，是分子伴侣的主要成分，对蛋白的跨防转运及特定构象的维

持等起着重要作用，是进化序列保守的蛋白之

3.3

聚合酶链式反应polymerasechainreaction,PCR

模板基因序列先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反五条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而互相结合，接着在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增

3.4

逆转录聚合酶链式反应reverse-transeriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR

RT-PCR是先利用依赖于RNA的DNA聚合酶，将待测RNA逆转录为DNA;再以逆转录后的一段DNA作为模板，以模板DNA两端序列互补的一对特异性寡核苷酸序列作为引物，在四种脱氧核糖核苷三磷酸存在下，利用依赖于DNA的DNA聚合酶的催化作用。经过数十次变性、退火和延伸的反应循环，使模板上介于两个引物之间的DNA片段得到特异性的技术扩增，再通过电泳等手段检测到被特异性扩增的片段。

3.5

tRNA“t结合区

tRNAm是携带延长肽链上甲硫氨酸的tRNA,它负责识别延伸中AUG密码子。tRNAm结合区

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为基因间隔区，该结合区为所有杆状病毒(Badnavirus)所共有。

4原理

根据PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的HSP-70特有碱基序列设计特异性引物进行RT-PCR扩增，依据是否分别扩增获得预期的590bp、611bp和499bp的DNA片段，判断样品中是否携带菠萝凋萎伴随病毒；根据PBCoV的tRNA结合区特有碱基序列设计特异性引物进行PCR扩增，依据是否扩增获得预期973bp的DNA片段，判断样品中是否携带菠萝杆状病毒。

5仪器设备、用具和试剂

按B.1和B.2的规定执行。

6取样PUBL

以田间菠萝大苗植株或冠芽较片或波萝组培苗叶片作为检测样品，取样量为1.0g~5.0g,实

验室检测用样量为9.1g。

7检测方法

7.1PMWaV的RT-PCR检测

7.1.1检测样品总RNA提取

参照附录B的方法提取检测样品和对照样品的总RNA.段超纯水作为空白对照进行RTPCR扩增