SNT 3577-2013 转基因成分检测 棉花PCR-DHPLC检测方法.docxVIP

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T3577—2013

转基因成分检测

棉花PCR-DHPLC检测方法

Detectionofgeneticallymodifiedcomponents—MethodforcottonusingPCR-DHPLC

2013-03-01发布2013-09-16实施

中国家华质量人监检验共检疫和总国局发布

I

SN/T3577—2013

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中国检验检疫科学研究院、深圳博睿祥晖生物技术有限公司、国家纳米科学中心。

本标准主要起草人：章桂明、朱水芳、向才玉、程颖慧、凌杏园、汪朝晖、朱劲松、黄新、欧阳辉、王颖、仲建忠。

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SN/T3577—2013

转基因成分检测

棉花PCR-DHPLC检测方法

1范围

本标准规定了进出境棉花中转基因成分和品系的PCR-DHPLC检测方法。

本标准中检测方法适用于转基因棉花品系MON531、MON1445、MON1698、MON15985中的转基因成分和品系的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法SN/T1193基因检验实验室技术要求

3原理

变性高效液相色谱技术(denaturinghigh-performanceliquidchromatography,DHPLC)是一种简单、快速、非凝胶的核酸分析方法，在50℃条件下分析样品，碱基对的数量决定样品峰的洗脱顺序，当过柱的乙腈浓度提高，核酸片段会根据相对分子质量从小到大的顺序被洗脱出来。本标准采用多重PCR方法针对转基因棉花含有的转基因成分同时进行扩增，扩增产物用DHPLC进行分析。通过DHPLC

得到的洗脱峰与marker比较确定相对分子质量大小，判定是否带有外源基因成分及确定转基因棉花品系。

4设备、用具及试剂

4.1设备及用具

组织粉碎机、PCR仪、DHPLC仪、水浴锅、电子天平(精度：1/1000以上)、普通离心机、低温冷冻高速离心机、冰箱、低温冰箱、制冰机、恒温干燥箱、pH计、移液器(0.1μL,0.5μL,2μL,10μL,20pL,100pL,200μL,1000μL)、紫外可见分光光度计、纯水机、高压消毒锅、PCR管(0.2mL)、离心管(1.5mL,2.0mL)、Tip头(0.1μL～10μL,5μL～200μL,100μL～500μL)。

4.2试剂

CTAB提取液、Tris饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、70%乙醇、RNA酶(10mg/mL)、多重PCR反应液缓冲液(MultiplexPCRMix)、TaqDNA聚合酶，DHPLC缓冲液A:TEAA(0.1mol/L,pH7.0)、乙

腈(0.025%),DHPLC缓冲液B:TEAA(0.1mol/L,pH7.0)、乙腈(25%),DHPLC缓冲液D:乙腈

(75%,pH7.0)、分子量标记(marker)。

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SN/T3577—2013

5抽样与制样

按照GB/T19495.7进行。

6DNA提取及浓度测定

6.1DNA提取

6.1.1CTAB方法

CTAB方法步骤如下：

a)称取300mg磨碎的样品(包括植株、种子和叶片等),迅速转入2mL离心管中，加65℃预热的CTAB提取液700p,混匀，放入65℃水浴锅中水浴30min;

b)加5μLRNase(10mg/mL),37℃水浴30min;

c)加入等体积Tris饱和酚，充分混匀，12000r/min离心15min;

d)取上清液，加入等体积的三氯甲烷/异戊醇(24×1)混匀，12000r/min离心10min,重复该步骤1次；

e)加入等体积预冷的异丙醇，轻轻摇晃，置于-20℃冰箱静置30min,12000r/min离心