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饲料中牛、绵羊和山羊源性成分的定性检测实时荧光PCR法
1范围
本文件规定了饲料中牛、绵羊和山羊源性成分的实时荧光PCR检测方法。
本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和饲料原料（包括动物组织及加工品）中牛、绵羊
和山羊源性成分的定性检测。
本文件相对检测限均为0.1%（W/W)，绝对检测限均为5拷贝DNA/PCR反应。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，
仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本
文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法
GB/T20195动物饲料试样的制备
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
实时荧光PCRreal-timePCR
在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。
3.2
Ct值cyclethreshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）
bp：碱基对（basepair）
PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）
Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)aminomethane]
EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）
CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammoniumbromide）
5原理
1
根据牛β-actin基因、绵羊催乳素受体基因和山羊9号染色体基因（均为单拷贝细胞核基因）的特异
性序列设计引物和探针，采用实时荧光PCR技术进行扩增，根据扩增反应中产生的荧光信号和Ct值实现
对牛、绵羊和山羊源性DNA成分成分的定性检测。
6试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。所有试剂均使用无DNA酶污染的容器存储或分
装。
6.12实时荧光PCR预混液。
×
6.2溶液配置用水：应符合GB/T6682二级水的要求。
6.3PCR用水：应符合GB/T6682一级水的要求，不含DNA酶和RNA酶。
6.40.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)：称取186.1gNaEDTA·2HO溶解于800mL水中，磁力搅拌器上22
剧烈搅拌，加入NaOH固体约20g，再滴加NaOH溶液调pH至8.0，定容至1000mL，在103.4kPa、121℃
条件下灭菌20min，室温保存。
6.5TE缓冲液（pH8.0）：分别量取10mLTris-HCl溶液和2mLEDTA溶液，加水定容至1000mL。
在103.4kPa、121℃条件下灭菌20min。
6.6引物和探针：用TE缓冲液或用一级水将每条引物和探针配制成100nmol/L储存液，置-20℃以
下冻存备用，避免多次冻融。序列见表1。
表1引物和探针序列
目标物种名称序列基因序列号
18SrRNA基18S-179bp-F5’-AGAGGGAGCCTGAGAAACGG-3’
因（内参对18S-179bp-R5’-CCAGACTTGCCCTCCAATGG-3’XR_003508809.1
照）18S-179bp-P5’-[FAM]-CCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCG-[TAMRA]-3’
Bov-62bp-FF:5′-GGCCTCGGAGTGTGTATTCAG-3′
牛Bov-62bp-RR:5′-GCCCCAGAATGAGGTTCACTT-3′NC_0373
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