血液标本采集和血涂片制备.pptVIP

b.蛋白质的化学性质：蛋白质中的氨基酸含有不同数量的氨基（-NH2）和羧基（-COOH），同时还有其它活性基团。在游离状态时，-NH2获得一个H+变成带正电的-NH3+，而-COOH失去一个H+变成带负电的-COO-。分别与不同染料结合。c.周围环境的酸碱度：如环境pH＜pI（pI为等电点），则蛋白质带正电，结合酸性染料；反之，pH＞pI，则结合碱性染料。第31页,共49页，星期六，2024年，5月细胞染色法的类型普通染色法：经物理和/或化学作用的吸附、结合荧光染色法：荧光染料，荧光显微镜细胞活体染色法：活体染料如灿烂甲酚蓝等细胞化学染色法：用化学反应显示细胞内某种成分细胞免疫化学染色法（应用单克隆抗体技术、酶标记技术）第32页,共49页，星期六，2024年，5月瑞氏染色法[瑞氏染料]由酸性染料伊红（eosin,E-）和碱性染料亚甲蓝(methyleneblue,M+)组成有复合染料。亚甲蓝为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。市售美蓝中部分已被氧化为天青。伊红通常为钠盐。将伊红和美蓝溶解在甲醇中，即瑞氏染料。第33页,共49页，星期六，2024年，5月

[染色原理]细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩，例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。M+CL+Na+E→ME+NaCL美蓝伊红伊红化美蓝（瑞氏染料）第34页,共49页，星期六，2024年，5月图1-4瑞氏染色原理示意图第35页,共49页，星期六，2024年，5月[PH对细胞染色有影响]细胞各种成分均为蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中正电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用玻片必须清洁，无酸碱污染。配制瑞氏染液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。第36页,共49页，星期六，2024年，5月[试剂]Wright染液：瑞氏染粉0.1g,甲醇60.0ml甲醇：有强大的脱水力，可将细胞固定为一定形态，并使蛋白质沉淀为颗粒状、网状等结构，增加细胞与染料接触表面积，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.4-6.8）：磷酸二氢钾（无水）0.3g，磷酸氢二钠（无水）0.2g,蒸馏水加到1000ml。配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口备用。第37页,共49页，星期六，2024年，5月[染色方法]1.用蜡笔在血膜两头划线，平放于染色架上。2.加瑞氏染液覆盖血膜，固定1min。3.滴加等量或稍多的缓冲液，混匀，染色5-10分钟。4.用清水冲洗，待干后镜检。第38页,共49页，星期六，2024年，5月【质量控制】血膜要干透后才能染色，否则染色时易脱落.染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关，一般染液淡、染色时间长些效果好。染液不能过少，以防蒸发沉淀。冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲，防止染料沉着。冲洗时间也不能长。染色过淡，可复染。染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色.第39页,共49页，星期六，2024年，5月第40页,共49页，星期六，2024年，5月【染色结果评价】正常情况：血膜外观呈淡琥珀色。在显微镜下红细胞染成粉红色，在厚薄均匀处略有碟状感。白细胞胞质中的颗粒能显示出各种细胞的特有色彩，细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。染色环境偏酸：则红细胞和嗜酸性颗粒偏红，白细胞核呈浅蓝色或不着色，染色过酸pH3.5时，则呈现一片红色，白细胞中除嗜酸性颗粒外均不着色。染色环境偏碱：则所有细胞呈灰蓝色，微偏碱者红细胞暗红、白细胞颗粒深暗。嗜酸性颗粒可染成暗褐色甚至黑紫色或蓝色。中性颗粒也偏粗染成紫黑色，血膜过厚的地方呈绿色。第41