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淋巴细胞增殖试验的标准操作规程（编号：035）
1、目的及适用范围
该SOP用来规范MTT法检测淋巴细胞转化效率的操作。
2、主要仪器
CO细胞培养箱、普通光学显微镜。超净工作台（生物安全级别）、电动吸引器、移液器、细
2
胞计数器
3、试剂及配制方法
RPIM-1640培养基、淋巴细胞分离液、MTT噻唑蓝（5mg/mL用PBS，pH=7.4配制后，过滤
除菌）
4、相关器皿的预处理
玻璃制品和金属制品高压灭菌
5、操作步骤
5.1分离小鼠脾细胞
5.1.1断颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2min。
5.1.2在超净台中用大头针固定，小心剪开小鼠的腹部外皮，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠
脾脏。注意无菌操作。
5.1.3在60mm培养皿中放入4-5mL淋巴细胞分离液，用镊子把尼龙网固定在皿上。然后用注射器
活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。
5.1.4把悬有脾脏细胞的分离液转移到离心管中，然后覆盖上大约1mL的1640培养基。
5.1.5800g离心30min。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集。
5.1.6吸出淋巴细胞层，加入10mL1640培养基洗涤一次，250g离心10min。倾倒上清液，加入
3-5mL含5%FBS的1640培养基重悬，细胞计数。
5.2接种细胞5
：用含10％FBS1640培养基配成单个细胞悬液，以每孔（1~8）×10个细胞/孔接种
到96孔板，每孔体积200μL；
5.3培养细胞：同一般培养条件，培养1～2d（可根据试验目的和要求决定培养时间）；
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5.4加刺激物：以超速离心和蔗糖梯度离心纯化的PRRSV病毒为实验刺激物，以同样方法纯化的
Marc-145细胞为阴性对照，并以ConA为阳性对照；继续培养；
5.5呈色：培养2～4d后，每孔加MTT溶液（5mg/mL用PBS;pH=7.4配)20μL。继续孵育4h，终
止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150μL
DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。
5.6比色：选择570nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。
5.7计算刺激系数（SI）：（实验组-空白组）/（阴性组-空白组）×100%。
6、问题向导
淋巴细胞增殖效率低见于哪些原因？
6.1分离到的淋巴细胞中含有未完全裂解的红细胞；
6.2细胞密度不均一，过密或过稀都会影响实验结果；
7、注意事项
7.1培养液pH应保持在7.4～7.6，过酸过碱均不利于细胞生长。
小牛血清用前需灭活。
7.2ConA的剂量过大对细胞有毒性，太小不足以刺激淋巴细胞转化，实验前应先测定ConA转化
反应剂量。
7.3实验中要严格无菌操作，防止污染。
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