琼脂糖凝胶电泳实验原理及步骤.pdfVIP

实验三琼脂糖凝胶电泳

一、实验原理

琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一

块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。

由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向

正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具

有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大

小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA，也可以分离相对分

子质量相同，而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对

分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照

物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。在凝胶中加入少量溴化乙

锭(ethidiumbromide,EB)，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合

物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA

进行检测。

一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段。本实

验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法。

二、仪器及试剂

1.仪器及耗材：

水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、微量移液器、透明胶

带、点样板或parafilm、100ml或250ml锥形瓶、量筒、吸头等。

2.试剂及配制：

50×TAE缓冲液的配制：2mol/LTris-乙酸，0.05mol/LEDTA（pH

8.0）

配制1000ml

Tris242g

冰乙酸57.1ml

0.5mol/LEDTA100ml

加入600ml去离子水后搅拌溶解，将溶液定容至1L后。高温高压灭菌，

室温保存。

1×TAE缓冲液的配制：

称量20ml的50×TAE缓冲液，再加入980ml的去离子水。

溴化乙啶贮存液：10mg/ml溴化乙啶

配制：100ml

称取1g溴化乙啶，置于100ml烧杯中，加入80ml去离子水后搅拌溶

解。将溶液定容至100ml后，转移到棕色瓶中。室温保存。

6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。

配制：10ml

溴酚蓝25mg

二甲苯青FF25mg

甘油3ml

用6×TAE缓冲液定溶至10ml，分装成1ml/管。-20℃保存。

其它试剂：DNA样品、DNALadder、琼脂糖、

三、操作步骤

1.制备1％琼脂糖凝胶(大胶用70ml，小胶用50ml)：称取0.7g（0.5

g）琼脂糖置于锥形瓶中，加入70ml（50ml）1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。微波

炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。

2.胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净、晾干，放入

制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置

于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀

小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶

层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽

放入电泳槽中。添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。

3.加样：在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲

液的最终稀释倍数应不小于1X。用10ul微量移液器分别将样品加入胶板的样

品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰